Summary
यहां, हम एक स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह स्वचालित संस्कृति प्रणाली श्रम को कम करती है और उपयोगकर्ताओं को लाभ पहुंचाती है, जिसमें प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं को संभालने से अपरिचित शोधकर्ता शामिल हैं, आईपीएस कोशिकाओं के रखरखाव से लेकर विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में भेदभाव तक।
Abstract
अनंत आत्म-प्रसार क्षमता वाले मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) से कई क्षेत्रों में आवेदन होने की उम्मीद की गई है, जिसमें दुर्लभ रोग विकृति की व्याख्या, नई दवाओं का विकास और क्षतिग्रस्त अंगों को बहाल करने के उद्देश्य से पुनर्योजी दवा शामिल है। इसके बावजूद, hiPSCs का सामाजिक कार्यान्वयन अभी भी सीमित है। यह आंशिक रूप से संस्कृति में भेदभाव को पुन: पेश करने की कठिनाई के कारण है, यहां तक कि उन्नत ज्ञान और परिष्कृत तकनीकी कौशल के साथ, आईपीएससी की उच्च संवेदनशीलता के कारण पर्यावरणीय परिवर्तनों को मिनट करने के लिए। एक स्वचालित संस्कृति प्रणाली का अनुप्रयोग इस मुद्दे को हल कर सकता है। एक शोधकर्ता के कौशल से स्वतंत्र उच्च प्रजनन क्षमता के साथ प्रयोगों की उम्मीद विभिन्न संस्थानों में एक साझा प्रक्रिया के अनुसार की जा सकती है। हालांकि कई स्वचालित संस्कृति प्रणालियों है कि IPSC संस्कृतियों को बनाए रखने और भेदभाव प्रेरित कर सकते हैं पहले विकसित किया गया है, इन प्रणालियों भारी हैं, बड़े, और महंगा क्योंकि वे मानवकृत, बहु व्यक्त रोबोट हथियारों का उपयोग करते हैं. उपरोक्त मुद्दों पर सुधार करने के लिए, हमने एक साधारण एक्स-वाई-जेड अक्ष स्लाइड रेल प्रणाली का उपयोग करके एक नई प्रणाली विकसित की, जिससे यह अधिक कॉम्पैक्ट, हल्का और सस्ता हो सके। इसके अलावा, उपयोगकर्ता नए हैंडलिंग कार्यों को विकसित करने के लिए नई प्रणाली में मापदंडों को आसानी से संशोधित कर सकता है। एक बार एक कार्य स्थापित है, सभी उपयोगकर्ता क्या करने की जरूरत है IPSC तैयार है, अग्रिम में वांछित कार्य के लिए आवश्यक अभिकर्मकों और उपभोग्य सामग्रियों की आपूर्ति, कार्य संख्या का चयन करें, और समय निर्दिष्ट. हमने पुष्टि की कि प्रणाली फीडर कोशिकाओं के बिना कई मार्ग के माध्यम से एक उदासीन राज्य में आईपीएससी को बनाए रख सकती है और कार्डियोमायोसाइट्स, हेपेटोसाइट्स, तंत्रिका पूर्वज और केराटिनोसाइट्स सहित विभिन्न सेल प्रकारों में अंतर कर सकती है। प्रणाली कुशल शोधकर्ताओं की आवश्यकता के बिना संस्थानों में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगों को सक्षम करेगी और नई प्रविष्टियों के लिए बाधाओं को कम करके अनुसंधान क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला में एचआईपीएससी के सामाजिक कार्यान्वयन की सुविधा प्रदान करेगी।
Introduction
इस लेख का उद्देश्य मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (आईपीएससी) के लिए एक स्वचालित संस्कृति प्रणाली के लिए वास्तविक और विस्तृत हैंडलिंग प्रक्रियाएं प्रदान करना है, जिसे हमने एक कंपनी के साथ सहयोग करके उत्पादित किया था, और प्रतिनिधि परिणाम दिखाने के लिए।
में लेख के प्रकाशन के बाद से 2007, आईपीएससी दुनिया भर में ध्यान आकर्षित किया गयाहै 1. दैहिक कोशिका के किसी भी प्रकार में अंतर करने में सक्षम होने की अपनी सबसे बड़ी विशेषता के कारण, यह पुनर्योजी चिकित्सा के रूप में विभिन्न क्षेत्रों में लागू होने की उम्मीद है, असाध्य रोगों के कारणों को स्पष्ट करने, और नई चिकित्सीय दवाओं 2,3 के विकास. इसके अलावा, मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न दैहिक कोशिकाओं का उपयोग पशु प्रयोगों को कम कर सकता है, जो महत्वपूर्ण नैतिक प्रतिबंधों के अधीन हैं। हालांकि कई सजातीय IPSC लगातार IPSC के साथ नए तरीकों अनुसंधान करने के लिए आवश्यक हैं, यह भी उन्हें प्रबंधित करने के लिए श्रमसाध्य है. अतिरिक्त, IPSC हैंडलिंग अपनी उच्च संवेदनशीलता की वजह से मुश्किल है, यहां तक कि सूक्ष्म सांस्कृतिक और पर्यावरणीय परिवर्तन करने के लिए.
इस समस्या को हल करने के लिए, स्वचालित संस्कृति प्रणालियों से मनुष्यों के बजाय कार्य करने की अपेक्षा की जाती है। कुछ समूहों ने सेल रखरखाव और भेदभाव के लिए कुछ स्वचालित मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल कल्चर सिस्टम विकसित किए हैं और अपनी उपलब्धियोंको 4,5,6प्रकाशित किया है। ये सिस्टम मल्टीआर्टिकुलेटेड रोबोटिक आर्म (ओं) से लैस हैं। रोबोटिक हथियारों में न केवल योग्यता है कि वे मानव हाथ आंदोलनों की अत्यधिक नकल करते हैं, बल्कि इसमें भी अवगुण हैं कि उन्हें हाथ (ओं) के लिए उच्च लागत (ओं), बड़ी और भारी प्रणाली पैकेजिंग, और इंजीनियरों द्वारा लक्षित आंदोलनों 7,8 प्राप्त करने के लिए समय लेने वाली शिक्षा प्रयासों की आवश्यकता होती है। आदेश में यह आसान आर्थिक के बिंदुओं पर अधिक अनुसंधान सुविधाओं के लिए तंत्र शुरू करने के लिए बनाने के लिए, अंतरिक्ष, और मानव संसाधन खपत, हम रखरखाव और विभिन्न सेल प्रकार9 में IPSC के भेदभाव के लिए एक उपन्यास स्वचालित संस्कृति प्रणाली विकसित की है.
नई प्रणाली के लिए हमारा तर्क बहु-व्यक्त रोबोटिक हथियारों के बजाय एक्स-वाई-जेड अक्ष रेल प्रणाली को अपनाना था9. रोबोटिक हथियारों के जटिल हाथ जैसे कार्यों को बदलने के लिए, हमने इस प्रणाली में एक नया विचार लागू किया, जो स्वचालित रूप से तीन प्रकार के विशिष्ट कार्यात्मक आर्म टिप्स को बदल सकता है। यहां, हम यह भी संकेत देते हैं कि पूरी प्रक्रिया में इंजीनियरों के योगदान के लिए आवश्यकताओं की कमी के कारण उपयोगकर्ता सॉफ़्टवेयर पर सरल ऑर्डर के साथ आसानी से कार्य शेड्यूल कैसे बना सकते हैं।
रोबोटिक संस्कृति प्रणालियों में से एक ने भेदभाव4 के लिए 3 डी सेल समुच्चय के रूप में 96-अच्छी प्लेटों का उपयोग करके भ्रूण निकायों के निर्माण का प्रदर्शन किया है। यहां रिपोर्ट की गई प्रणाली 96-अच्छी प्लेटों को संभाल नहीं सकती है। एक ने सेल लाइन का उपयोग करके वर्तमान अच्छा विनिर्माण अभ्यास (सीजीएमपी) ग्रेड हासिल किया, हालांकि यह मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल5 नहीं था। यहाँ विस्तृत स्वचालित संस्कृति प्रणाली अब प्रयोगशाला प्रयोगों (चित्रा 1) की मदद करने के विशिष्ट उद्देश्य के साथ विकसित किया गया है. हालांकि, इसमें स्तर IV सुरक्षा कैबिनेट के बराबर स्वच्छ स्तर रखने के लिए पर्याप्त प्रणालियां हैं।
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Protocol
Kansai चिकित्सा विश्वविद्यालय की आचार समिति पीढ़ी और स्वस्थ स्वयंसेवक व्युत्पन्न IPSC नाम के उपयोग को मंजूरी दे दी KMUR001 (अनुमोदन नहीं. 2020197). दाता, जिसे खुले तौर पर भर्ती किया गया था, ने औपचारिक सूचित सहमति प्रदान की और कोशिकाओं के वैज्ञानिक उपयोग से सहमत हुए।
नोट: वर्तमान इंटरफ़ेस (विंडोज एक्सपी ऑपरेटिंग सिस्टम के तहत चलने वाला "सीसीएसएसएचएमआई" नामक विशेष सॉफ्टवेयर) मौलिक ऑपरेशन स्क्रीन है। उपरोक्त इंटरफ़ेस के तहत, टैब की एक श्रृंखला की व्यवस्था की जाती है, जिससे उपयोगकर्ता विभिन्न ऑपरेशन शुरू कर सकते हैं।
1. लोडिंग संचालन
- दबाएं लोड हो रहा है सॉफ्टवेयर की शीर्ष स्क्रीन पर बटन। लोडिंग तैयारी स्टार्ट बटन पर क्लिक करें।
- उपकरण में स्थिति में उपकरण में प्रवेश करने के लिए डिश (तों) या प्लेट (प्लेटों) को रखें।
नोट: डिश पहचान के लिए आवश्यक जानकारी प्रत्येक ढक्कन पर लिखी जानी चाहिए। - फ्रंट स्लाइडिंग विंडो को मैन्युअल रूप से बंद करें और यांत्रिक सुरक्षा-पुष्टिकरण बटन दबाएं।
- सॉफ्टवेयर में डिश (तों) या प्लेट (ओं) के प्रकार और मात्रा का चयन करें।
- लोडिंग तैयारी पूर्ण बटन पर क्लिक करें। लोडिंग स्टार्ट बटन पर क्लिक करें।
- एक डिश सिस्टम में अपलोड किया जाता है के बाद, इस तरह के आईपीएस कोशिकाओं के साथ या आईपीएस कोशिकाओं के बिना, सॉफ्टवेयर पर पकवान पर जानकारी का चयन करें. सॉफ्टवेयर में प्रत्येक डिश के बारे में नोट्स पंजीकृत करें।
- लोडिंग ऑपरेशन को पूरा करने के लिए अंत में पंजीकरण बटन पर क्लिक करें।
2. उतराई ऑपरेशन
- दबाएं उतार सॉफ्टवेयर की शीर्ष स्क्रीन पर बटन। सॉफ्टवेयर में हटाए जाने वाले डिश (डिशों) का चयन करें।
- डिश (तों) का चयन करने के बाद, अनलोडिंग तैयारी स्टार्ट बटन पर क्लिक करें। अनलोडिंग स्टार्ट बटन पर क्लिक करें।
- डिश (तों) को इनक्यूबेटर से सिस्टम में कार्यक्षेत्र में स्थानांतरित करने के बाद, डिश रिमूवल बटन दबाएं।
- मैन्युअल रूप से फ्रंट स्लाइडिंग विंडो खोलें और डिश (डिशों) को बाहर निकालें। फ्रंट स्लाइडिंग विंडो को मैन्युअल रूप से बंद करें और यांत्रिक सुरक्षा-पुष्टिकरण बटन दबाएं।
3. उपभोग्य सामग्रियों के पूरक: पिपेट, ट्यूब और मध्यम
- उपभोग्य सामग्रियों जैसे पिपेट, ट्यूब और माध्यम को फिर से भरने के लिए, सॉफ़्टवेयर की शीर्ष स्क्रीन पर उपभोग्य सामग्रियों के बटन पर क्लिक करें, फिर उस आइटम का चयन करें जिसे फिर से भरना है।
- पिपेट
- पिपेट बटन पर क्लिक करें. Replenish बटन का चयन करें।
- एक रैक का चयन करें जिसे उपयोगकर्ता सॉफ़्टवेयर पर फिर से भरना चाहता है। रिप्लेनिश स्टार्ट बटन पर क्लिक करें।
- यह पुष्टि करने के बाद कि कार्यक्षेत्र पर विंदुक भंडारण क्षेत्र का ढक्कन खोला गया है, मैन्युअल रूप से सामने स्लाइडिंग विंडो खोलें और आवश्यकतानुसार पिपेट को फिर से भरें।
- फ्रंट स्लाइडिंग विंडो को मैन्युअल रूप से बंद करें और यांत्रिक सुरक्षा-पुष्टिकरण बटन दबाएं। रिप्लेनिश कम्प्लीट बटन पर क्लिक करें।
- पुनःपूर्ति सेटअप बटन पर क्लिक करें और पुनःपूर्ति के लिए जानकारी दर्ज करें, फिर पंजीकरण बटन पर क्लिक करें।
- रिप्लेनिश कम्प्लीट बटन पर क्लिक करें।
- ट्यूब
- ट्यूब बटन पर क्लिक करें। Replenish बटन का चयन करें।
- एक रैक का चयन करें जिसे उपयोगकर्ता सॉफ़्टवेयर पर फिर से भरना चाहता है। रिप्लेनिश स्टार्ट बटन पर क्लिक करें।
- यह पुष्टि करने के बाद कि रैक शीर्ष पर चला गया है, फिर से भरना ट्यूब बटन पर क्लिक करें।
- मैन्युअल रूप से फ्रंट स्लाइडिंग विंडो खोलें और आवश्यकतानुसार ट्यूबों को फिर से भरें।
- फ्रंट स्लाइडिंग विंडो को मैन्युअल रूप से बंद करें और यांत्रिक सुरक्षा-पुष्टिकरण बटन दबाएं।
- रिप्लेनिश कम्प्लीट बटन पर क्लिक करें।
- पुनःपूर्ति सेटअप बटन पर क्लिक करें और पुनःपूर्ति के लिए जानकारी दर्ज करें, फिर पंजीकरण बटन पर क्लिक करें। बंद करें बटन पर क्लिक करें।
- मध्यम
- मध्यम बटन पर क्लिक करें। सॉफ्टवेयर में रिप्लेनिश बटन का चयन करें।
- तीन में से एक रैक का चयन करें जिसे उपयोगकर्ता फिर से भरना चाहते हैं। रिप्लेनिश स्टार्ट बटन पर क्लिक करें।
- यह पुष्टि करने के बाद कि मध्यम भंडारण क्षेत्र का ढक्कन खोल दिया गया है, मैन्युअल रूप से फ्रंट स्लाइडिंग विंडो खोलें और माध्यम को फिर से भरें।
- फ्रंट स्लाइडिंग विंडो को मैन्युअल रूप से बंद करें और यांत्रिक सुरक्षा-पुष्टिकरण बटन दबाएं।
- रिप्लेनिश कम्प्लीट बटन पर क्लिक करें।
- पुनःपूर्ति बटन पर क्लिक करें और माध्यम के नाम और मात्रा सहित माध्यम के लिए जानकारी दर्ज करें। यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त टिप्पणियाँ दर्ज करें।
- पंजीकरण बटन पर क्लिक करें।
- बंद करें बटन पर क्लिक करें।
- पिपेट
4. कार्य चयन
- सॉफ़्टवेयर की शीर्ष स्क्रीन पर कार्य बटन पर क्लिक करें।
- कार्य सेटिंग बटन का चयन करें. कार्य सूची से इच्छित कार्य का चयन करें और अगला चरण बटन क्लिक करें.
- कार्य करने के लिए दिनांक और समय निर्दिष्ट करें, और उसके बाद पंजीकरण बटन क्लिक करें। कार्य करने के लिए एक डिश या प्लेट का चयन करें, और फिर पंजीकरण बटन पर क्लिक करें।
- चयनित कार्य की पुन: पुष्टि करने के बाद, पंजीकरण बटन पर क्लिक करें। पुष्टि करें कि कार्य अगली स्क्रीन पर पंजीकृत किया गया है।
- यदि आवश्यक हो, तो अगले कार्य को उसी तरह सेट करें।
- अंत में स्टार्ट बटन पर क्लिक करें। फिर, कार्य निर्दिष्ट दिनांक और समय पर स्वचालित रूप से प्रारंभ हो जाएगा।
नोट: हर कार्य को पूरा करने के तुरंत बाद, यूवी रोशनी (हुड के दो किनारों पर स्थित) स्वचालित रूप से चालू हो जाती है, और 5-30 मिनट के बाद, सहायक सेटिंग के अनुसार, उन्हें सड़न रोकनेवाला स्थिति में हुड रखने के लिए बंद कर दिया जाता है। रोकने के लिए, उपयोगकर्ता स्टार्ट बटन पर क्लिक कर सकते हैं। - यदि उपयोगकर्ता किसी शेड्यूल किए गए कार्य को पहले से रद्द करना चाहते हैं, तो स्टॉप बटन पर क्लिक करें।
- निरस्त किए जाने वाले कार्य का चयन करने के बाद, कार्य संपादित करें बटन पर क्लिक करें।
- कार्य रद्द करें बटन क्लिक करें. पुष्टि करें कि कार्य अगली स्क्रीन पर हटा दिया गया है।
5. सेल चित्रों की जाँच करें
- प्रत्येक कार्य में कार्य कार्य से पहले और बाद में सूक्ष्म अवलोकन (फोटो लेना) शामिल हैं। प्रत्येक कार्य से पहले या बाद में एक सूक्ष्म फोटोग्राफी कार्य को शामिल करके सेल संस्कृति फोटोग्राफिक रूप से सेल संस्कृति की प्रगति का निरीक्षण करें।
- समय के साथ एक ही स्थान की निगरानी के लिए फिक्स्ड-पॉइंट अवलोकन के लिए अग्रिम में डिश या अच्छी तरह से प्लेट के कई विशिष्ट स्थानों का चयन करने सहित पूर्व-निर्धारित कार्य कार्यक्रमों का चयन करें।
6. पासिंग और भेदभाव
- अनुभाग 1-5 में दिए गए चरणों का पालन करें और पासिंग और भेदभाव करने के लिए स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली सेट करें। पासिंग, कार्डियोमायोसाइट भेदभाव, हेपेटोसाइट भेदभाव, तंत्रिका अग्रदूत सेल भेदभाव, और केराटिनोसाइट भेदभाव के लिए उपकरण सेटिंग्स क्रमशः तालिका 1, तालिका 2, तालिका 3, तालिका 4 और तालिका 5 में दिखाए गए हैं।
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Representative Results
मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का रखरखाव
हमने तीन एचपीएससी लाइनों (रिकेन-2एफ, 253 जी 1, और KMUR001) का इस्तेमाल किया। हमने दैनिक मैन्युअल रूप से किए गए प्रयोगों के माध्यम से रखरखाव प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया है और सिस्टम द्वारा किए गए सात प्रारंभिक प्रयोगों के माध्यम से विस्तृत कार्यक्रमों को और अनुकूलित किया है। उदाहरण के लिए, मनुष्यों और सिस्टम द्वारा नियंत्रित विभिन्न पाइपों से थूक प्रवाह की तरल गति के कारण कतरनी तनाव काफी अलग हैं; इसलिए, हमने एंजाइमी पाचन की समय लंबाई और सिस्टम द्वारा सेल फैलाव के लिए पाइपिंग की संख्या को अनुकूलित किया।
मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को 10 सेमी डिश पर बनाए रखा गया था जो 0.5 माइक्रोग्राम / सेमी2 सेल कल्चर मैट्रिक्स के साथ हिपीएससी संस्कृति माध्यम (जैसे, न्यूट्रिस्टेम या स्टेमफिट AK02N) के साथ लेपित था। पारित होने के लिए, सिस्टम को कैल्शियम (पीबीएस [-]) के बिना फॉस्फेट बफर खारा के 5 एमएल के साथ तीन बार एचआईपीएससी धोने के लिए प्रोग्राम किया गया था, फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए रो किनेज इनहिबिटर (वाई -27632) के 10 माइक्रोन के साथ पूरक ट्रिपल एक्सप्रेस एंजाइम के 3 एमएल के साथ इलाज करें। उसके बाद, सिस्टम ने प्लेट में 0.15% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन अंश वी (बीएसए) के साथ पीबीएस (-) के 9 एमएल को जोड़ा और गति के दो सेटों का प्रदर्शन किया जो सेल युक्त तरल के 10 एमएल को एस्पिरेटेड करता है और प्लेट के शीर्ष पर एक ज़िग-ज़ैग गति में पिपेट टिप से तरल को तिरस्कृत करता है, जो प्लेट की सतह के करीब 20 डिग्री झुका हुआ था, और विपरीत दिशा में 20 ° पर झुकी हुई प्लेट के साथ संचालन के उपरोक्त अनुक्रम को दोहराया। फिर, सिस्टम ने सेल युक्त माध्यम को 15-एमएल ट्यूब में एकत्र किया और इसे कैप किया, जिसके बाद कोशिकाओं को जमा करने के लिए इसे 5 मिन के लिए 115 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। इसके बाद, सिस्टम ने सतह पर तैरनेवाला एस्पिरेटेड किया और 10 बार पाइपिंग करके 10 माइक्रोन वाई -27632 के साथ संस्कृति माध्यम के 10 एमएल का उपयोग करके सेल गोली को एकल कोशिकाओं में फैलाया। सिस्टम ने 1 एमएल ट्रिपैन ब्लू सॉल्यूशन को एक नए 15 एमएल ट्यूब में ट्रांसफर किया, फिर सेल सस्पेंशन के 1 एमएल को जोड़ा और उन्हें पांच बार पाइपिंग करके मिलाया। उसके बाद, ट्राइपैन ब्लू-सना हुआ सेल समाधान के 100 माइक्रोन को एस्पिरेटेड किया गया था और धारक में डिस्पोजेबल हेमोसाइटोमीटर की इनलेट विंडो में तिरस्कृत किया गया था। सिस्टम ने हेमोसाइटोमीटर धारक को सूक्ष्म अवलोकन क्षेत्र में स्थानांतरित कर दिया, और एक तस्वीर पर कब्जा कर लिया, जिसे तुरंत सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण किया गया था, और प्राप्त सेल एकाग्रता को अगले चरण पर लागू किया गया था। IPSC रखरखाव के लिए, प्रणाली 0.5 μg/सेमी2 सेल संस्कृति मैट्रिक्स के साथ लेपित नए 10 सेमी व्यास प्लास्टिक प्लेटों में 15,000 कोशिकाओं/सेमी2 की एक सेल घनत्व पर कोशिकाओं वरीयता प्राप्त. भेदभाव प्रयोगों के लिए, प्रणाली 1/100 करने के लिए पतला एक सेल संस्कृति मैट्रिक्स के साथ लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेटों में प्रत्येक दैहिक सेल प्रकार के लिए तैयार माध्यम में आवश्यक सेल घनत्व में कोशिकाओं वरीयता प्राप्त. अंत में, सिस्टम ने प्लेटों को इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करने से पहले पांच बार क्रॉस-लॉकिंग का प्रदर्शन किया। आईपीएससी और तीन सेल कल्चर मैट्रिक्स-प्री-लेपित प्लेटों वाले तीन नए 10-सेमी प्लेटों को सिस्टम में लोड किया गया था, और अन्य आवश्यक वस्तुओं को भी ऊपर वर्णित संबंधित प्रक्रियाओं के अनुसार तैयार किया गया था। रखरखाव संस्कृति के एक चक्र में दिन 1 पर एक पासिंग कार्य होता है, जिसके बाद 3 दिनों के लिए दिन में एक बार संस्कृति माध्यम परिवर्तन होता है। प्रयोग के दौरान, यह चक्र पांच चक्रों के लिए स्थापित किया गया था। इसके अलावा, उपभोग्य सामग्रियों को बदले में फिर से भर दिया गया था।
आदेशित अनुसूची के अनुसार, रखरखाव संस्कृति के पांच चक्रों को सिस्टम द्वारा योजना के अनुसार सफलतापूर्वक किया गया था। प्रत्येक कार्य के दौरान स्वचालित रूप से ली गई सेल तस्वीरों से, यह पुष्टि की गई कि कोशिकाएं समय के साथ सुचारू रूप से फैल गईं। सेल विस्तार (एन = 3) की गणना की गई और चित्रा 2 में दिखाया गया था। यह पुष्टि करने के लिए कि स्वचालित संस्कृति प्रणाली में रखरखाव संस्कृति के बाद भी आईपीएससी की उदासीन स्थिति अपरिवर्तित रहती है, इम्यूनोसाइटोमेटोरिक विश्लेषण (अक्टूबर 3/4 और एसएसईए 4) प्रत्येक पासिंग (चित्रा 3 ए) में शेष नमूनों का उपयोग करके किया गया था। इसके अलावा, पांच चक्रों के बाद, तीन व्यंजन सिस्टम से उतार दिए गए थे, और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण (अक्टूबर 3/4, एसएसईए 4, और टीआर 1-81) भी किया गया था (चित्रा 3 बी)। फ्लोरोसेंट इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग करके दोनों विश्लेषणों से पता चला है कि आईपीएस कोशिकाओं की उदासीन स्थिति संरक्षित थी। IPSC के Karyotyping भी पहले और एक स्वचालित संस्कृति प्रणाली में रखरखाव संस्कृति के बाद प्रदर्शन किया गया था. हालांकि रखरखाव संस्कृति की शुरुआत से पहले गुणसूत्र 17 के एलील में एक असामान्यता देखी गई थी, असामान्यता (चित्रा 3सी)सहित 5 रखरखाव संस्कृतियों के बाद सिस्टम द्वारा कोई विशेष परिवर्तन नहीं देखा गया था। IPSC के रखरखाव के लिए इस्तेमाल किया सेटिंग्स तालिका में संक्षेप कर रहे हैं 1.
अवकलन
कार्डियोमायोसाइट्स
पिछले प्रकाशन से भेदभाव प्रोटोकॉल यहाँ10 का पालन किया गया था. प्रणाली ने सेल कल्चर मैट्रिक्स-लेपित 6-वेल प्लेट्स पर 30,000 कोशिकाओं/सेमी2 के घनत्व पर वाई-27632 के 10 माइक्रोन के साथ पूरक एचआईपीएससी (KMUR001) को वरीयता दी। प्रणाली ने 3 दिनों (भेदभाव दिन 1) के बाद GSK-3ß अवरोधक CHIR-99021, 20 ng/mL एक्टिविन A, और 10 ng/mL BMP4 के 6 माइक्रोन के साथ माध्यम से मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल माध्यम में माध्यम बदल दिया। भेदभाव दिवस 3 पर, सिस्टम सीडीएम 3 माध्यम में बदल गया: आरपीएमआई 1640, 500 माइक्रोग्राम / एमएल पुनः संयोजक मानव एल्ब्यूमिन, और 213 माइक्रोन / एमएल एल-एस्कॉर्बिक एसिड 2-फॉस्फेट 2 माइक्रोन डब्ल्यूएनटी-सी 59 के साथ। भेदभाव दिवस 5 पर, सिस्टम ताजा सीडीएम 3 माध्यम में बदल गया; इसके बाद, यह हर दूसरे दिन ताजा सीडीएम 3 माध्यम में बदलता रहता है। IPSC के cardiomyocyte भेदभाव के लिए इस्तेमाल सेटिंग्स तालिका 2 में संक्षेप कर रहे हैं.
हेपेटोसाइट्स
पिछले प्रकाशन से भेदभाव प्रोटोकॉल यहाँ11 का पालन किया गया था. प्रणाली ने सेल कल्चर मैट्रिक्स-लेपित 6-वेल प्लेट्स पर 25,000 कोशिकाओं/सेमी2 के घनत्व पर वाई-27632 के 10 माइक्रोन के साथ पूरक एचआईपीएससी (RIKEN2F) को वरीयता दी। 2 दिनों (भेदभाव दिन 1) के बाद, सिस्टम ने माध्यम को आरपीएमआई -1640 प्लस 2% बी 27 माइनस इंसुलिन (आरपीएमआई-बी 27) में बदल दिया जिसमें 100 एनजी / एमएल एक्टिविन ए, 6 माइक्रोन सीएचआईआर -99021, और 1% ग्लूटामाइन पूरक (जैसे, ग्लूटामैक्स) 24 घंटे के लिए। भेदभाव दिवस 2 पर, हमने 50 एनजी/एमएल एक्टिविन ए के साथ माध्यम को आरपीएमआई-बी 27 में बदल दिया। भेदभाव दिवस 5 पर, सिस्टम ने माध्यम को आरपीएमआई-बी 27 में बदल दिया, जिसमें 1% ग्लूटामाइन पूरक और 10 एनजी / एमएल बीएमपी -4 शामिल थे। भेदभाव दिवस 9 पर, सिस्टम ने माध्यम को हेपेटोसाइट परिपक्वता माध्यम में बदल दिया: लीबोविट्ज़ के एल -15 माध्यम में 8.3% ट्रिप्टोज फॉस्फेट शोरबा, 10 माइक्रोन हाइड्रोकार्टिसोन 21-हेमिसुकेट, 50 माइक्रोग्राम / एमएल सोडियम एल-एस्कॉर्बेट, 100 एनएम डेक्सामेथासोन, 0.58% इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम, 2 एमएम ग्लूटामाइन पूरक, 8.3% भ्रूण गोजातीय सीरम, और 100 एनएम आरएसी -1,2-डिहेक्साडेसिलग्लिसरॉल। इसके बाद, सिस्टम ने हर दूसरे दिन माध्यम को एक नए माध्यम में बदलने के लिए दोहराया। IPSC के hepatocyte भेदभाव के लिए इस्तेमाल सेटिंग्स तालिका 3 में संक्षेप कर रहे हैं.
न्यूरोनल अग्रदूत कोशिकाएं
पिछले प्रकाशन से भेदभाव प्रोटोकॉल यहाँ12 का पालन किया गया था. प्रणाली ने 25,000 कोशिकाओं/सेमी2 के घनत्व पर RIKEN2F डुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम)/एफ 12 और न्यूरोबेसल माध्यम (1: 1) में बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 6-अच्छी प्लेटों पर 10% नॉकआउट सीरम प्रतिस्थापन, 0.1 मिमी गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 10 माइक्रोन टीजीएफ-बीटा रिसेप्टर अवरोधक (SB431542), 10 माइक्रोन बीएमपी सिग्नल अवरोधक (डोरसोमोर्फिन) के साथ पूरक के साथ 1 एमएम ग्लूटामाइन पूरक को वरीयता दी, और 10 माइक्रोन वाई -27632 (भेदभाव दिन 1)। भेदभाव दिवस 5 पर, प्रणाली डीएमईएम / एफ 12 और न्यूरोबेसल माध्यम 1: 1 0.1 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 1 मिमी ग्लूटामाइन पूरक, 1% एन -2 पूरक, 1% बी -27 पूरक, 50 माइक्रोग्राम / एमएल एस्कॉर्बिक एसिड 2-फॉस्फेट, 10 माइक्रोन SB431542, और 10 माइक्रोन डोरसोमोर्फिन के साथ पूरक करने के लिए माध्यम बदल दिया। भेदभाव दिवस 9 पर, प्रणाली डीएमईएम / एफ 12 और न्यूरोबेसल माध्यम 1: 1 0.1 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 1 मिमी ग्लूटामाइन पूरक, 1% एन -2 पूरक, 1% बी -27 पूरक, 50 μg / एमएल एस्कॉर्बिक एसिड 2-फॉस्फेट, और 1 माइक्रोन सभी ट्रांस रेटिनोइक एसिड के साथ पूरक करने के लिए माध्यम बदल दिया. भेदभाव दिवस 13-16 पर, सिस्टम डीएमईएम / एफ 12 और न्यूरोबेसल माध्यम 1: 1 के साथ हर दिन माध्यम बदल गया, 0.1 एमएम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 1 एमएम ग्लूटामाइन पूरक, 1% एन -2 पूरक, 1% बी -27 पूरक, 50 माइक्रोग्राम / एमएल एस्कॉर्बिक एसिड 2-फॉस्फेट, और 10 एनजी / एमएल बीएफजीएफ और 10 एनजी / एमएल ईजीएफ। IPSC के तंत्रिका अग्रदूत सेल भेदभाव के लिए इस्तेमाल सेटिंग्स तालिका 4 में संक्षेप कर रहे हैं.
केराटिनोसाइट्स
पिछले प्रकाशन से भेदभाव प्रोटोकॉल यहाँ13 का पालन किया गया था. प्रणाली ने 10 माइक्रोन वाई-27632 के साथ एचआईपीएससी संस्कृति माध्यम में सेल संस्कृति मैट्रिक्स-लेपित 6-अच्छी प्लेटों में सेल संस्कृति मैट्रिक्स-लेपित 6-अच्छी प्लेटों में 15,000 कोशिकाओं/सेमी2 के घनत्व पर उदासीन hiPSCs (253G1) को वरीयता दी। 2 दिनों के बाद (भेदभाव दिन 1), सिस्टम ने माध्यम को डुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) / एफ 12 और न्यूरोबेसल माध्यम (1: 1) में 0.1 एमएम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 1 एमएम ग्लूटामाइन, 55 माइक्रोन 2-मर्कैप्टोथेनॉल, 1% एन -2 पूरक, 2% बी -27 पूरक, 50 माइक्रोग्राम / एमएल एस्कॉर्बिक एसिड 2-फॉस्फेट, 0.05% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन, और 100 एनजी / एमएल एफजीएफ-बेसिक। भेदभाव दिन 3 पर, और उसके बाद, माध्यम को मानव केराटिनोसाइट माध्यम में बदल दिया गया था (दिन 3 के लिए पूरक के बिना और दिन 5 पर / बाद के पूरक के साथ) 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल हाइड्रोकार्टिसोन, 1 माइक्रोन ऑल-ट्रांस रेटिनोइक एसिड, 25 एनजी / एमएल एचबीएमपी -4, 2.4 माइक्रोग्राम / एमएल एडेनिन, 1.37 एनजी / एमएल ट्राईआयोडोथायरोनिन, 0.3 एमएम एस्कॉर्बिक एसिड 2-फॉस्फेट, और 2 माइक्रोन forskolin, सिस्टम द्वारा हर 2 दिन। IPSC के keratinocyte भेदभाव के लिए इस्तेमाल सेटिंग्स तालिका 5 में संक्षेप कर रहे हैं.
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, पूरी प्रक्रिया केवल स्वचालित संस्कृति उपकरण का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया था, आईपीएस कोशिकाओं को बीजारोपण से लेकर भेदभाव प्रोटोकॉल की बाद की श्रृंखला तक। प्रत्येक सेल में विशेषता मार्करों की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया गया था(चित्रा 4)। यह दिखाया गया था कि भेदभाव केवल एक स्वचालित संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके प्रेरित किया जा सकता है।
चित्रा 1: स्वचालित संस्कृति प्रणाली का सारांश। (ए) आकार और लेआउट स्केच दिखाने वाली प्रणाली का चित्र 1. (बी) कार्यक्षेत्र और लेआउट स्केच का चित्र 2. (सी) हाथ उपकरण: पकवान, ट्यूब और पिपेट। यह आंकड़ा बंडो एट अल 9 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: पासिंग कार्य और सेल विकास। (ए) वर्ग प्रत्येक प्रक्रिया को दिखाता है। (बी) IPSC विस्तार तीन स्वतंत्र प्रयोगों में हर स्वचालित सेल गिनती का उपयोग कर गणना. (सी) प्रतिनिधि छवियों को मार्ग से मार्ग तक स्वचालित रूप से कैप्चर किया गया। स्केल बार = 400 माइक्रोन और 100 माइक्रोन (इनसेट)। यह आंकड़ा बंडो एट अल 9 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: आईपीएससी के स्वचालित दीर्घकालिक रखरखाव। (ए) अक्टूबर-3/4 और एसएसईए-4 के लिए तीन स्वतंत्र प्रयोगों के सभी इम्यूनोसाइटोमेटोरिक विश्लेषण। प्रत्येक नीला हिस्टोग्राम कोई प्राथमिक एंटीबॉडी नियंत्रण इंगित नहीं करता है। प्रत्येक लाल हिस्टोग्राम संकेतित एंटीजन-विशिष्ट संकेत का प्रतिनिधित्व करता है। (बी)अक्टूबर -3/4, एसएसईए -4, और ट्रा 1-81 के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल रूप से सना हुआ कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (सी) पांचवें मार्ग के बाद RIKEN2F-आईपीएससी के कैरियोटाइप। यह आंकड़ा बंडो एट अल 9 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला। हेपेटोसाइट्स (स्केल बार = 100 माइक्रोन), कार्डियोमायोसाइट्स (स्केल बार = 100 माइक्रोन), न्यूरोनल पूर्वज कोशिकाओं (स्केल बार = 100 माइक्रोन), और केराटिनोसाइट्स (स्केल बार = 200 माइक्रोन) के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल चित्र। यह आंकड़ा बंडो एट अल 9 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 1: पैसेज की तैयारी और सिस्टम सेटिंग्स। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 2: कार्डियोमायोसाइट भेदभाव की तैयारी और सिस्टम सेटिंग्स। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 3: हेपेटोसाइट भेदभाव की तैयारी और सिस्टम सेटिंग्स। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 4: तंत्रिका अग्रदूत सेल भेदभाव की तैयारी और सिस्टम सेटिंग्स। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 5: केराटिनोसाइट भेदभाव की तैयारी और सिस्टम सेटिंग्स। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम यह है कि यदि किसी उपयोगकर्ता को कोई दोष मिलता है, तो किसी भी समय रद्द करें, रोकें या रीसेट करें बटन पर क्लिक करें और पहले चरण से शुरू करें। सॉफ्टवेयर मानवीय गलतियों से बच सकता है, जिसमें दोहरी बुकिंग, सिस्टम कार्य सक्रिय होने पर दरवाजे खोलना और पुनःपूर्ति की कमी शामिल है। वांछित दैहिक सेल के लिए सफल और कुशल भेदभाव के लिए एक और महत्वपूर्ण बिंदु प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल लाइनों का उचित चयन है क्योंकि प्रत्येक प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल में इसके भेदभाव गुणों14,15 में एक बेकाबू पूर्वाग्रह है।
प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के लिए यह स्वचालित संस्कृति प्रणाली उन्हें विभिन्न दैहिक सेल प्रकारों में बनाए रख सकती है और अलग कर सकती है। इस प्रणाली का आकार 200 सेमी (चौड़ाई), 110 सेमी (गहराई), और 233 सेमी (ऊंचाई) है, जिसका कुल वजन 1.2 टन है। डिवाइस में निर्मित इनक्यूबेटर एक साथ छत्तीस 10-सेमी व्यंजन और नौ मल्टीवेल प्लेट रख सकता है।
पिछले मॉडलों में सुधार यह है कि सबसे पहले, एक हैंडलिंग आर्म के रूप में, एक्स-वाई-जेड-अक्ष रेल प्रणाली को 6-अक्ष व्यक्त हाथ से परिवर्तित किया गया था, जो हाथ के टिप टूल को व्यंजन, ट्यूब और पिपेट के लिए तीन अलग-अलग भागों में बदलकर काम करता है। हाथ सिस्टम की छत से निलंबित है और एक्स-वाई-जेड अक्ष के साथ चलता है। दूसरा, एक सेल गिनती प्रणाली फीडर मुक्त रखरखाव संस्कृतियों और भेदभाव प्रेरण प्रोटोकॉल है कि पारित से लगातार प्रदर्शन कर रहे हैं के लिए शुरू किया गया था. ट्रिपैन ब्लू समाधान के साथ एकल-सेल निलंबन समाधान को मिलाने के बाद, इसे सूक्ष्म अवलोकन और इमेजिंग के लिए एक डिस्पोजेबल हेमोसाइटोमीटर में स्थानांतरित किया गया था। सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से जीवित कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए प्राप्त छवि का विश्लेषण करता है और कोशिकाओं की आवश्यक संख्या को बीज देने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करता है। इस छवि विश्लेषण द्वारा प्राप्त सेल गणना की सटीकता मैन्युअल रूप से प्राप्त के अनुरूप थी।
एक्स-वाई-जेड-अक्ष रेल प्रणाली को पिछले संस्करण (बहु-अक्षों व्यक्त हाथ) की तुलना में प्रत्येक कार्य को जल्दी से संभालने के लिए लागू किया गया था। इस स्वचालित संस्कृति प्रणाली के साथ, 16 दिनों के लिए पांच निरंतर मार्ग किए गए थे, और आईपीएससी का विस्तार 625 ± 93 गुना किया गया था। हालांकि फीडर कोशिकाओं के बिना सेल रखरखाव के समय के लिए धीरज का सबूत फीडर कोशिकाओं के साथ हमारे पिछले प्रदर्शन से कम था, सेल विस्तार पिछले प्रदर्शन6 के साथ तुलना में अधिक कुशल था. छोटा कार्य समय कार्यों के दौरान सूखने से सेल क्षति को रोकने में योगदान करने के लिए लग रहा था।
इसके अलावा, रखरखाव संस्कृति से कार्डियोमायोसाइट्स, हेपेटोसाइट्स, न्यूरोनल अग्रदूत कोशिकाओं और केराटिनोसाइट्स में भेदभाव के लिए भेदभाव कार्य मानव हस्तक्षेप के बिना किए गए थे। इन पाठ्यक्रमों की एक श्रृंखला के बाद, प्रतिदीप्ति इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा पुष्टि की गई थी कि अकेले स्वचालित संस्कृति प्रणाली में प्राप्त कोशिकाओं ने वांछित कोशिकाओं में विभेदित किया था। इसलिए, एक कार्य कार्यक्रम साझा करने और इस प्रणाली का उपयोग करके, आईपीएस सेल प्रबंधन से परिचित नहीं हैं जो शोधकर्ताओं अपने स्वयं के अनुसंधान के लिए आईपीएससी-व्युत्पन्न दैहिक कोशिकाओं को प्राप्त कर सकते हैं. इसके अलावा, शोधकर्ताओं या सुविधाओं के बीच प्रजनन क्षमता में अंतर जितना संभव हो उतना समाप्त किया जा सकता है, और यह आश्वस्त कर सकता है कि सजातीय गुणवत्ता की कोशिकाएं हर बार प्राप्त की जाती हैं।
एक नई रेल प्रणाली को अपनाने से, उपकरण को छोटा किया जा सकता है और वजन में 1.2 टन, ~ 200 किलोग्राम पहले की तुलना में हल्का किया जा सकता है। इसके अलावा, भागों और कार्यक्रम सेटिंग लागत लगभग $ 10,000 अमेरिकी डॉलर से कम किया जा सकता है। रखरखाव और प्रोग्रामिंग लागत में 13% की गिरावट का अनुमान लगाया गया था। अधिक शोधकर्ताओं को आसानी से आईपीएस सेल से संबंधित अनुसंधान में प्रवेश करने के लिए प्रेरित करने के लिए, उपकरण की लागत कम रखना भी महत्वपूर्ण है6. हमें उम्मीद है कि वर्तमान और अगली पीढ़ी के स्वचालित संस्कृति प्रणालियों IPSC और अधिक समान गुणवत्ता के IPSC व्युत्पन्न विभेदित कोशिकाओं प्रदान करने में मदद करने के लिए योगदान में से एक होगा.
इस प्रणाली की प्रमुख सीमाएं संस्कृतियों के अस्थायी भंडारण के लिए रेफ्रिजरेटर की सीमित क्षमता और तरल की छोटी मात्रा (<100 μL) को संभालने में इसकी कमजोरी हैं। इसके अलावा, परिष्कृत कृत्रिम बुद्धिमत्ता की कमी ऑन-टाइम सेल स्थिति के अनुसार स्वचालित अनुकूलन को अक्षम करती है। मामूली सीमा सिस्टम निर्माताओं 4,5 द्वारा प्रदान की विशेष विंदुक सुझावों की आवश्यकता है. हम अगली पीढ़ी की संस्कृति प्रणालियों का विकास कर रहे हैं जो मध्यम तैयारी के लिए थोड़ी मात्रा में तरल को संभालने में सक्षम होंगे और इसमें उच्च प्रदर्शन कृत्रिम बुद्धिमत्ता (सिस्टम लर्निंग) के आधार पर एक प्रतिक्रिया अनुकूलन प्रणाली शामिल होगी। हमारे सहयोगी निर्माता9 के पास उपयोगकर्ताओं की विशेष आवश्यकताओं के अनुसार कस्टम-निर्मित सिस्टम बनाने के लिए पर्याप्त जानकारी है। इसके अलावा, अधिक सामान्य और व्यापक कार्यों से लैस अगली पीढ़ी के सिस्टम जल्द ही बाजार में होंगे। हम सभी उपयोगकर्ताओं को अप-टू-डेट सिस्टम की आपूर्ति करने के लिए सदस्यता-आधारित किराये की प्रणाली पर भी विचार कर रहे हैं।
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Disclosures
लेखक के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस अध्ययन को न्यू बिजनेस प्रमोशन सेंटर, पैनासोनिक प्रोडक्शन इंजीनियरिंग कं, लिमिटेड, ओसाका, जापान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
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