Summary
Aquí, presentamos un protocolo para un sistema automatizado de cultivo celular. Este sistema de cultivo automatizado reduce la mano de obra y beneficia a los usuarios, incluidos los investigadores que no están familiarizados con el manejo de células madre pluripotentes inducidas (iPS), desde el mantenimiento de las células iPS hasta la diferenciación en varios tipos de células.
Abstract
Se espera que las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) con una capacidad infinita de autoproliferación tengan aplicaciones en numerosos campos, incluida la elucidación de patologías de enfermedades raras, el desarrollo de nuevos medicamentos y la medicina regenerativa con el objetivo de restaurar órganos dañados. A pesar de ello, la implementación social de las hiPSC sigue siendo limitada. Esto se debe, en parte, a la dificultad de reproducir la diferenciación en la cultura, incluso con conocimientos avanzados y habilidades técnicas sofisticadas, debido a la alta sensibilidad de las iPSC a los cambios ambientales más pequeños. La aplicación de un sistema de cultivo automatizado puede resolver este problema. Se pueden esperar experimentos con alta reproducibilidad, independientemente de la habilidad de un investigador, de acuerdo con un procedimiento compartido entre varios institutos. Aunque anteriormente se han desarrollado varios sistemas de cultivo automatizados que pueden mantener cultivos iPSC e inducir la diferenciación, estos sistemas son pesados, grandes y costosos porque hacen uso de brazos robóticos humanizados y multiarticulados. Para mejorar los problemas anteriores, desarrollamos un nuevo sistema que utiliza un sistema de rieles deslizantes de eje x-y-z simple, lo que le permite ser más compacto, liviano y económico. Además, el usuario puede modificar fácilmente los parámetros del nuevo sistema para desarrollar nuevas tareas de manipulación. Una vez que se establece una tarea, todo lo que el usuario debe hacer es preparar el iPSC, suministrar los reactivos y consumibles necesarios para la tarea deseada con anticipación, seleccionar el número de tarea y especificar el tiempo. Confirmamos que el sistema podía mantener las iPSC en un estado indiferenciado a través de varios pasajes sin células alimentadoras y diferenciarse en varios tipos de células, incluidos cardiomiocitos, hepatocitos, progenitores neurales y queratinocitos. El sistema permitirá experimentos altamente reproducibles en todas las instituciones sin necesidad de investigadores cualificados y facilitará la implementación social de las hiPSC en una gama más amplia de campos de investigación al disminuir los obstáculos para nuevas entradas.
Introduction
Este artículo tiene como objetivo proporcionar procedimientos de manejo reales y detallados para un sistema de cultivo automatizado de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC), que producimos en colaboración con una empresa, y mostrar resultados representativos.
Desde la publicación del artículo en 2007, iPSC ha atraído la atención de todo el mundo1. Debido a su mayor característica de poder diferenciarse en cualquier tipo de célula somática, se espera que se aplique en diversos campos como la medicina regenerativa, la elucidación de las causas de enfermedades intratables y el desarrollo de nuevos fármacos terapéuticos 2,3. Además, el uso de células somáticas humanas derivadas de iPSC podría reducir los experimentos con animales, que están sujetos a importantes restricciones éticas. Aunque se requieren constantemente numerosas iPSC homogéneas para investigar nuevos métodos con iPSC, es demasiado laborioso gestionarlas. Además, el manejo de iPSC es difícil debido a su alta sensibilidad, incluso a cambios culturales y ambientales sutiles.
Para resolver este problema, se espera que los sistemas de cultivo automatizados realicen tareas en lugar de humanos. Algunos grupos han desarrollado algunos sistemas automatizados de cultivo de células madre pluripotentes humanas para el mantenimiento y la diferenciación celular y han publicado sus logros 4,5,6. Estos sistemas equipan brazos robóticos multiarticulados. Los brazos robóticos no solo tienen el mérito de imitar en gran medida los movimientos de los brazos humanos, sino también el de que requieren costos más altos para los brazos, un empaquetamiento del sistema más grande y pesado, y esfuerzos educativos que consumen mucho tiempo por parte de los ingenieros para obtener los movimientos deseados 7,8. Con el fin de facilitar la introducción del aparato en más instalaciones de investigación en los puntos de consumo económico, espacial y de recursos humanos, hemos desarrollado un novedoso sistema de cultivo automatizado para el mantenimiento y diferenciación de iPSC en varios tipos de células9.
Nuestra justificación para el nuevo sistema fue adoptar un sistema de rieles de eje X-Y-Z en lugar de brazos robóticos multiarticulados9. Para reemplazar las complejas funciones similares a las manos de los brazos robóticos, aplicamos una nueva idea a este sistema, que puede cambiar automáticamente tres tipos de puntas de brazo funcionales específicas. Aquí, también indicamos cómo los usuarios pueden hacer fácilmente programaciones de tareas con pedidos simples en el software debido a la falta de requisitos para las contribuciones de los ingenieros a lo largo del proceso.
Uno de los sistemas de cultivo robótico ha demostrado la fabricación de cuerpos embrioides utilizando placas de 96 pocillos como agregados celulares 3D para la diferenciación4. El sistema que se informa aquí no puede manejar placas de 96 pocillos. Una de ellas alcanzó el grado actual de buenas prácticas de fabricación (cGMP) utilizando una línea celular, aunque no se trataba de una célula madre pluripotente humana5. El sistema de cultivo automatizado que se detalla aquí se ha desarrollado con el objetivo específico de ayudar a los experimentos de laboratorio (Figura 1). Sin embargo, cuenta con suficientes sistemas para mantener limpios niveles equivalentes a los de un armario de seguridad de nivel IV.
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Protocol
El Comité de Ética de la Universidad Médica de Kansai aprobó la generación y el uso de las iPSC sanas derivadas de voluntarios denominadas KMUR001 (aprobación n.º 2020197). El donante, que fue reclutado abiertamente, dio su consentimiento informado formal y estuvo de acuerdo con el uso científico de las células.
NOTA: La interfaz actual (el software especial llamado "ccssHMI" que se ejecuta en el sistema operativo Windows XP) es la pantalla de operación fundamental. En la interfaz antes mencionada, se organizan una serie de pestañas que permiten a los usuarios iniciar diversas operaciones.
1. Operaciones de carga
- Haga clic en el botón Cargar en la pantalla superior del software. Haga clic en el botón Inicio de preparación de carga .
- Coloque el(los) plato(s) o plato(s) que se introducirá en el aparato en su posición en el aparato.
NOTA: La información necesaria para la identificación del plato debe estar escrita en cada tapa. - Cierre manualmente la ventana corredera delantera y presione el botón mecánico de confirmación de seguridad.
- Seleccione el tipo y la cantidad de plato(s) o plato(s) en el software.
- Haga clic en el botón Preparación de carga completada . Haga clic en el botón Inicio de carga .
- Después de cargar una antena parabólica en el sistema, seleccione la información de la antena, como con celdas iPS o sin celdas iPS, en el software. Registre notas sobre cada plato en el software.
- Haga clic en el botón Registro al final para completar la operación de carga.
2. Operación de descarga
- Haga clic en el botón Descargar en la pantalla superior del software. Seleccione los platos que desea eliminar en el software.
- Después de seleccionar los platos, haga clic en el botón Inicio de preparación de descarga . Haga clic en el botón Inicio de descarga .
- Después de que la(s) placa(s) se haya transferido(s) de la incubadora al banco de trabajo del sistema, presione el botón Extracción de platos .
- Abra manualmente la ventana corredera frontal y saque los platos. Cierre manualmente la ventana corredera delantera y presione el botón mecánico de confirmación de seguridad.
3. Suplemento de consumibles: pipetas, tubos y medio
- Para reponer consumibles como pipetas, tubos y medios, haga clic en el botón Consumibles en la pantalla superior del software y, a continuación, seleccione el artículo que desea reponer.
- Pipetas
- Haga clic en el botón Pipeta . Seleccione el botón Reabastecer .
- Seleccione un bastidor que el usuario desee reabastecer en el software. Haga clic en el botón Iniciar reabastecimiento .
- Después de confirmar que la tapa del área de almacenamiento de pipetas en el banco de trabajo está abierta, abra manualmente la ventana corredera frontal y reponga las pipetas según sea necesario.
- Cierre manualmente la ventana corredera delantera y presione el botón mecánico de confirmación de seguridad. Haga clic en el botón Reabastecer completado .
- Haga clic en el botón Configuración de reabastecimiento e introduzca la información para el reabastecimiento, luego haga clic en el botón Registro .
- Haga clic en el botón Reabastecer completado .
- Tubos
- Haz clic en el botón Tubo . Seleccione el botón Reabastecer .
- Seleccione un bastidor que el usuario desee reabastecer en el software. Haga clic en el botón Iniciar reabastecimiento .
- Después de confirmar que la rejilla se ha movido a la parte superior, haga clic en el botón Reabastecer tubo .
- Abra manualmente la ventana corredera frontal y reponga los tubos según sea necesario.
- Cierre manualmente la ventana corredera delantera y presione el botón mecánico de confirmación de seguridad.
- Haga clic en el botón Reabastecer completado .
- Haga clic en el botón Configuración de reabastecimiento e introduzca la información para el reabastecimiento, luego haga clic en el botón Registro . Haga clic en el botón Cerrar .
- Medio
- Haga clic en el botón Medio . Seleccione el botón Reabastecer en el software.
- Seleccione un bastidor de los tres que los usuarios desean reabastecer. Haga clic en el botón Iniciar reabastecimiento .
- Después de confirmar que se ha abierto la tapa del área de almacenamiento mediana, abra manualmente la ventana corredera frontal y reponga el medio.
- Cierre manualmente la ventana corredera delantera y presione el botón mecánico de confirmación de seguridad.
- Haga clic en el botón Reabastecer completado .
- Haga clic en el botón Reabastecer e introduzca la información del medio, incluido el nombre y la cantidad del medio. Introduzca comentarios adicionales si es necesario.
- Haga clic en el botón Registro .
- Haga clic en el botón Cerrar .
- Pipetas
4. Selección de tareas
- Haga clic en el botón Tarea en la pantalla superior del software.
- Seleccione el botón Configuración de tareas . Seleccione la tarea deseada de la lista de tareas y haga clic en el botón Siguiente paso .
- Especifique la fecha y la hora para realizar la tarea y, a continuación, haga clic en el botón Registro . Seleccione un plato para realizar la tarea y, a continuación, haga clic en el botón Registro .
- Después de volver a confirmar la tarea seleccionada, haga clic en el botón Registro . Confirme que la tarea se ha registrado en la siguiente pantalla.
- Si es necesario, establezca la siguiente tarea de la misma manera.
- Haga clic en el botón Inicio al final. A continuación, la tarea se iniciará automáticamente en la fecha y hora especificadas.
NOTA: Inmediatamente después de terminar cada tarea, las luces UV (ubicadas en ambos lados de la campana) se encienden automáticamente y, después de 5-30 minutos, de acuerdo con la configuración auxiliar, se apagan para mantener la campana en condiciones asépticas. Para detenerlo, los usuarios pueden hacer clic en el botón Inicio . - Si los usuarios desean cancelar una tarea programada por adelantado, haga clic en el botón Detener .
- Después de seleccionar la tarea que se va a anular, haga clic en el botón Editar tarea .
- Haga clic en el botón Cancelar tarea . Confirme que la tarea se ha eliminado en la siguiente pantalla.
5. Revisa las imágenes de las celdas
- Cada tarea incluye observaciones microscópicas (toma de fotos) antes y después del trabajo de la tarea. Observar fotográficamente el progreso del cultivo celular incorporando una tarea de fotografía microscópica antes o después de cada tarea.
- Seleccione programas de tareas preestablecidos, incluida la selección de múltiples ubicaciones específicas del plato o la placa de pocillos con anticipación para la observación de puntos fijos para monitorear la misma ubicación a lo largo del tiempo.
6. Pasaje y diferenciación
- Siga los pasos de las secciones 1 a 5 y configure el sistema automatizado de cultivo celular para realizar el paso y la diferenciación. Los ajustes del instrumento para el paso, la diferenciación de cardiomiocitos, la diferenciación de hepatocitos, la diferenciación de células precursoras neurales y la diferenciación de queratinocitos se muestran en la Tabla 1, Tabla 2, Tabla 3, Tabla 4 y Tabla 5, respectivamente.
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Representative Results
Mantenimiento de células madre pluripotentes inducidas por humanos
Se utilizaron tres líneas hPSC (RIKEN-2F, 253G1 y KMUR001). Hemos optimizado el protocolo de mantenimiento a través de experimentos diarios realizados manualmente y optimizado aún más los programas detallados a través de los siete experimentos preliminares realizados por el sistema. Por ejemplo, las tensiones de cizallamiento causadas por las velocidades del líquido del flujo de saliva de diferentes pipetas manejadas por humanos y el sistema son bastante diferentes; Por lo tanto, optimizamos el tiempo de digestión enzimática y el número de pipeteos para la dispersión celular por parte del sistema.
Las células madre pluripotentes inducidas humanas se mantuvieron en una placa de 10 cm recubierta con una matriz de cultivo celular de 0,5 μg/cm2 con medio de cultivo hiPSC (p. ej., Neutristem o StemFit AK02N). Para el paso, el sistema se programó para lavar hiPSC tres veces con 5 mL de solución salina tampón fosfato sin calcio (PBS[-]), luego tratar con 3 mL de enzima TrypLE express suplementada con 10 μM del inhibidor de la Rho quinasa (Y-27632) durante 15 min a 37 °C. Después de eso, el sistema agregó 9 mL de PBS(-) con albúmina sérica bovina al 0,15% fracción V (BSA) a la placa y realizó dos series de movimiento que aspiraron 10 mL de líquido que contenía células y dispensaron el líquido desde la punta de la pipeta en un movimiento en zig-zag a través de la parte superior de la placa, que se inclinó 20° más cerca de la superficie de la placa. y repitió la secuencia anterior de operaciones con la placa inclinada a 20° en el lado opuesto. A continuación, el sistema recogió el medio que contenía células en un tubo de 15 ml y lo tapó, tras lo cual se centrifugó a 115 x g durante 5 minutos para depositar las células. A partir de entonces, el sistema aspiró el sobrenadante y dispersó el gránulo celular en células individuales utilizando 10 mL de medio de cultivo con 10 μM Y-27632 pipeteando 10 veces. El sistema transfirió 1 mL de solución de azul de tripano a un nuevo tubo de 15 mL, luego agregó 1 mL de la suspensión celular y los mezcló pipeteando cinco veces. Después de eso, se aspiraron 100 μL de la solución celular teñida con azul de tripano y se dispensaron en la ventana de entrada del hemocitómetro desechable en el soporte. El sistema trasladó el soporte del hemocitómetro al área de observación microscópica y capturó una foto, que fue analizada inmediatamente por software, y la concentración celular obtenida se aplicó al siguiente paso. Para el mantenimiento de iPSC, el sistema sembró las células a una densidad celular de 15.000 células/cm2 en nuevas placas de plástico de 10 cm de diámetro recubiertas con una matriz de cultivo celular de 0,5 μg/cm2 . Para los experimentos de diferenciación, el sistema sembró las células a la densidad celular requerida en el medio preparado para cada tipo de célula somática en placas de 6 pocillos recubiertas con una matriz de cultivo celular diluida a 1/100. Finalmente, el sistema realizó el bloqueo cruzado cinco veces antes de transferir las placas a la incubadora. Se cargaron en el sistema tres nuevas placas de 10 cm que contenían iPSC y tres placas prerrevestidas de matriz de cultivo celular, y también se prepararon otros elementos necesarios de acuerdo con los procedimientos respectivos mencionados anteriormente. Un ciclo de cultivo de mantenimiento consiste en una tarea de paso el día 1 seguida de un cambio de medio de cultivo una vez al día durante 3 días. A lo largo del experimento, este ciclo se configuró para cinco ciclos. Además, los consumibles se repusieron a su vez.
De acuerdo con el cronograma ordenado, se realizaron con éxito cinco ciclos de cultivo de mantenimiento según lo planificado por el sistema. A partir de las fotografías celulares tomadas automáticamente durante cada tarea, se confirmó que las células proliferaban sin problemas a lo largo del tiempo. Se calculó la expansión celular (n = 3) y se muestra en la Figura 2. Para confirmar si el estado indiferenciado de las iPSC permanece inalterado incluso después del cultivo de mantenimiento en el sistema de cultivo automatizado, se realizó un análisis inmunocitométrico (Oct3/4 y SSEA4) utilizando las muestras restantes en cada paso (Figura 3A). Además, después de cinco ciclos, las tres placas se descargaron del sistema y se realizó un análisis inmunohistoquímico (Oct3/4, SSEA4 y Tra1-81) (Figura 3B). Ambos análisis mediante inmunotinción fluorescente mostraron que se conservaba el estado indiferenciado de las células iPS. También se realizó el cariotipo de las iPSC antes y después del cultivo de mantenimiento en un sistema de cultivo automatizado. Aunque se observó una anomalía en un alelo del cromosoma 17 antes del inicio del cultivo de mantenimiento, no se observó ningún cambio particular en el sistema después de 5 cultivos de mantenimiento, incluida la anomalía (Figura 3C). En el Cuadro 1 se resumen los ajustes utilizados para el mantenimiento de las iPSC.
Diferenciación
Cardiomiocitos
Aquí se siguió el protocolo de diferenciación de una publicación anterior10. El sistema sembró hiPSCs indiferenciadas (KMUR001) a una densidad de 30.000 células/cm2 en placas de 6 pocillos recubiertas de matriz de cultivo celular en medio de cultivo hiPSC suplementado con 10 μM de Y-27632. El sistema cambió el medio a medio de células madre pluripotentes humanas con 6 μM del inhibidor de GSK-3ß CHIR-99021, 20 ng/mL de activina A y 10 ng/mL de BMP4 después de 3 días (día 1 de diferenciación). En el día 3 de diferenciación, el sistema cambió a medio CDM3: RPMI 1640, 500 μg/mL de albúmina humana recombinante y 213 μg/mL de ácido L-ascórbico 2-fosfato con 2 μM de Wnt-C59. En el día 5 de diferenciación, el sistema cambió a un medio CDM3 fresco; a partir de entonces, se repitió el cambio a un nuevo medio CDM3 cada dos días. En la Tabla 2 se resumen los ajustes utilizados para la diferenciación de cardiomiocitos de las iPSC.
Hepatocitos
Aquí se siguió el protocolo de diferenciación de una publicación anterior11. El sistema sembró hiPSCs indiferenciadas (RIKEN2F) a una densidad de 25.000 células/cm2 en placas de 6 pocillos recubiertas de matriz de cultivo celular en medio de cultivo hiPSC suplementado con 10 μM de Y-27632. Después de 2 días (día 1 de diferenciación), el sistema cambió el medio a RPMI-1640 más 2% de B27 menos insulina (RPMI-B27) que contenía 100 ng/ml de activina A, 6 μM de CHIR-99021 y un suplemento de glutamina al 1% (p. ej., GlutaMAX) durante 24 h. En el día 2 de diferenciación, cambiamos el medio a RPMI-B27 con 50 ng/mL de Activina A. En el día 5 de diferenciación, el sistema cambió el medio a RPMI-B27, que contenía un suplemento de glutamina al 1% y 10 ng/mL de BMP-4. En el día 9 de diferenciación, el sistema cambió el medio a medio de maduración de hepatocitos: medio L-15 de Leibovitz que contenía un 8,3% de caldo de fosfato de triptosa, 10 μM de hidrocortisona 21-hemisuccino, 50 μg/mL de L-ascorbato de sodio, 100 nM de dexametasona, 0,58% de insulina-transferrina-selenio, 2 mM de suplemento de glutamina, 8,3% de suero fetal bovino y 100 nM de rac-1,2-dihexadecilglicerol. A partir de entonces, el sistema repitió el cambio del medio a un medio nuevo cada dos días. En la Tabla 3 se resumen los ajustes utilizados para la diferenciación de hepatocitos de las iPSC.
Células precursoras neuronales
Aquí se siguió el protocolo de diferenciación de una publicación anterior12. El sistema sembró hiPSCs indiferenciadas (RIKEN2F) a una densidad de 25.000 células/cm2 en placas de 6 pocillos recubiertas de matriz de membrana basal en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 y medio neurobasal (1:1) suplementado con un 10% de reemplazo sérico Knockout, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 1 mM de suplemento de glutamina con 10 μM de inhibidor del receptor TGF-beta (SB431542), 10 μM de inhibidor de la señal BMP (dorsomorfina), y 10 μM Y-27632 (día 1 de diferenciación). En el día 5 de diferenciación, el sistema cambió el medio a DMEM/F12 y medio neurobasal 1:1 suplementado con 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 1 mM de suplemento de glutamina, 1% de suplemento de N-2, 1% de suplemento de B-27, 50 μg/mL de ácido ascórbico 2-fosfato, 10 μM de SB431542 y 10 μM de dorsomorfina. En el día 9 de diferenciación, el sistema cambió el medio a DMEM/F12 y medio neurobasal 1:1 suplementado con 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 1 mM de suplemento de glutamina, 1% de suplemento de N-2, 1% de suplemento de B-27, 50 μg/mL de ácido ascórbico 2-fosfato y 1 μM de ácido transretinoico. En el día 13-16 de diferenciación, el sistema cambió el medio todos los días con DMEM/F12 y medio neurobasal 1:1 suplementado con 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 1 mM de suplemento de glutamina, 1% de suplemento de N-2, 1% de suplemento de B-27, 50 μg/mL de ácido ascórbico 2-fosfato y 10 ng/mL de bFGF y 10 ng/mL de EGF. En la Tabla 4 se resumen los ajustes utilizados para la diferenciación de células precursoras neurales de las iPSC.
Queratinocitos
Aquí se siguió el protocolo de diferenciación de una publicación anterior13. El sistema sembró hiPSCs indiferenciadas (253G1) a una densidad de 15.000 células/cm2 en placas de cultivo celular de 6 pocillos recubiertas de matriz en medio de cultivo hiPSC con 10 μM Y-27632. Después de 2 días (día 1 de diferenciación), el sistema cambió el medio a medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 y medio Neurobasal (1:1) con 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 1 mM de glutamina, 55 μM de 2-mercaptoetanol, 1% de suplemento de N-2, 2% de suplemento de B-27, 50 μg/mL de ácido ascórbico 2-fosfato, 0,05% de albúmina sérica bovina y 100 ng/mL de FGF-básico. En el día 3 de diferenciación, y a partir de entonces, el medio se cambió a medio de queratinocitos humanos (sin suplemento para el día 3 y con un suplemento en el día 5 o después) con la adición de 0,5 μg/mL de hidrocortisona, 1 μM de ácido transretinoico, 25 ng/mL hBMP-4, 2,4 μg/mL de adenina, 1,37 ng/mL de triyodotironina, 0,3 mM de ácido ascórbico 2-fosfato, y 2 μM de forskolina, cada 2 días por el sistema. En la Tabla 5 se resumen los ajustes utilizados para la diferenciación de queratinocitos de las iPSC.
Como se mencionó anteriormente, todo el proceso se realizó utilizando únicamente equipos de cultivo automatizados, desde la siembra de células iPS hasta la posterior serie de protocolos de diferenciación. Se evaluó la expresión de marcadores característicos en cada célula (Figura 4). Se demostró que la diferenciación podía ser inducida utilizando solo un sistema de cultivo automatizado.
Figura 1: Resumen del sistema de cultivo automatizado. (A) Imagen del sistema que muestra el tamaño y el boceto de diseño 1. (B) Imagen del banco de trabajo y croquis de diseño 2. (C) Herramientas manuales: plato, tubo y pipeta. Esta figura ha sido modificada con permiso de Bando et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Tarea de paso y crecimiento celular. (A) El cuadrado ilustra cada proceso. (B) Expansión de iPSC calculada utilizando cada recuento de células automatizado en los tres experimentos independientes. (C) Imágenes representativas capturadas automáticamente de un pasaje a otro. Barras de escala = 400 μm y 100 μm (recuadro). Esta figura ha sido modificada con permiso de Bando et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Mantenimiento automatizado a largo plazo de iPSC. (A) Todos los análisis inmunocitométricos de los tres experimentos independientes para Oct-3/4 y SSEA-4. Cada histograma azul indica que no hay control primario de anticuerpos. Cada histograma rojo representa la señal específica del antígeno indicada. (B) Imágenes representativas de células teñidas inmunohistoquímicamente para Oct-3/4, SSEA-4 y Tra 1-81. Barras de escala = 50 μm. (C) Cariotipo del RIKEN2F-iPSC después del quinto paso. Esta figura ha sido modificada con permiso de Bando et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Tinción inmunohistoquímica. Imágenes inmunohistoquímicas de hepatocitos (barras de escala = 100 μm), cardiomiocitos (barras de escala = 100 μm), células progenitoras neuronales (barras de escala = 100 μm) y queratinocitos (barras de escala = 200 μm). Esta figura ha sido modificada con permiso de Bando et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Preparativos de paso y configuración del sistema. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Preparaciones de diferenciación de cardiomiocitos y configuración del sistema. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 3: Preparaciones de diferenciación de hepatocitos y configuración del sistema. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 4: Preparaciones de diferenciación de células precursoras neurales y configuración del sistema. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 5: Preparaciones de diferenciación de queratinocitos y configuración del sistema. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Un paso crítico en el protocolo es que si un usuario encuentra alguna falla, haga clic en el botón cancelar, detener o restablecer en cualquier momento y comience de nuevo desde el primer paso. El software puede evitar errores humanos, como la doble reserva, la apertura de puertas mientras las tareas del sistema están activas y la falta de reabastecimiento. Otro punto crítico para una diferenciación exitosa y eficiente a la célula somática deseada es la selección adecuada de líneas de células madre pluripotentes, ya que cada célula madre pluripotente tiene un sesgo incontrolable en sus propiedades de diferenciación14,15.
Este sistema de cultivo automatizado de células madre pluripotentes inducidas puede mantenerlas y diferenciarlas en varios tipos de células somáticas. El tamaño de este sistema es de 200 cm (ancho), 110 cm (profundidad) y 233 cm (alto), con un peso total de 1,2 toneladas. La incubadora integrada en el dispositivo puede contener simultáneamente treinta y seis platos de 10 cm y nueve platos de pocillos múltiples.
Las mejoras con respecto a los modelos anteriores son que, en primer lugar, como brazo de manipulación, el sistema de rieles del eje X-Y-Z se convirtió recientemente de un brazo articulado de 6 ejes, que funciona cambiando la herramienta de punta del brazo a tres partes diferentes para platos, tubos y pipetas. El brazo está suspendido del techo del sistema y se mueve a lo largo del eje X-Y-Z. En segundo lugar, se introdujo un sistema de recuento celular para cultivos de mantenimiento sin alimentador y protocolos de inducción de diferenciación que se realizan de forma continua desde el paso. Después de mezclar la solución de suspensión unicelular con la solución de azul de tripano, se transfirió a un hemocitómetro desechable para su observación microscópica y obtención de imágenes. El software analiza automáticamente la imagen obtenida para contar el número de células vivas y calcular el volumen necesario para sembrar el número requerido de células. La precisión de los recuentos celulares obtenidos por este análisis de imágenes fue consistente con la obtenida manualmente.
Se aplicó el sistema de rieles X-Y-Z para manejar cada tarea más rápido que la versión anterior (brazo articulado multieje). Con este sistema de cultivo automatizado, se realizaron cinco pases continuos durante 16 días y las iPSC se ampliaron 625 ± 93 veces. Aunque la prueba de resistencia durante el tiempo de mantenimiento de la célula sin células alimentadoras fue más corta que nuestra demostración anterior con células alimentadoras, la expansión celular fue más eficiente en comparación con la demostración anterior6. El tiempo de trabajo más corto pareció contribuir a evitar que el daño celular se secara durante las tareas.
Además, las tareas de diferenciación, desde el cultivo de mantenimiento hasta la diferenciación en cardiomiocitos, hepatocitos, células precursoras neuronales y queratinocitos, se realizaron sin intervención humana. Después de una serie de estos cursos, se confirmó mediante inmunotinción de fluorescencia que las células obtenidas en el sistema de cultivo automatizado por sí solas se habían diferenciado en las células deseadas. Por lo tanto, al compartir un programa de tareas y utilizar este sistema, los investigadores que no están familiarizados con el manejo de células iPS pueden obtener células somáticas derivadas de iPSC para su propia investigación. Además, se podrían eliminar en la medida de lo posible las diferencias de reproducibilidad entre investigadores o instalaciones, y se podría asegurar que se obtengan células de calidad homogénea en todo momento.
Al adoptar un nuevo sistema de rieles, el equipo podría reducirse y reducirse en peso a 1,2 toneladas, ~ 200 kg más ligero que antes. Además, los costos de configuración de piezas y programas podrían reducirse en aproximadamente $ 10,000 dólares estadounidenses. Se estimó que los costos de mantenimiento y programación disminuirían en un 13%. Con el fin de motivar a más investigadores a entrar fácilmente en la investigación relacionada con las células iPS, también es importante mantener bajos los costes de los equipos6. Esperamos que los sistemas de cultivo automático actuales y de próxima generación sean una de las contribuciones para ayudar a proporcionar iPSC y células diferenciadas derivadas de iPSC de calidad más uniforme.
Las principales limitaciones de este sistema son la capacidad limitada del refrigerador para el almacenamiento tentativo de cultivos y su debilidad en el manejo de pequeñas cantidades (<100 μL) de líquido. Además, la falta de inteligencia artificial sofisticada deshabilita la optimización automática de acuerdo con la condición de la celda a tiempo. La limitación menor es el requisito de puntas de pipeta especiales proporcionadas por los fabricantes del sistema 4,5. Estamos desarrollando la próxima generación de sistemas de cultivo que serán capaces de manejar pequeñas cantidades de líquido para preparaciones medianas e incluir un sistema de optimización de retroalimentación basado en inteligencia artificial de alto rendimiento (aprendizaje del sistema). Nuestro fabricante colaborador9 tiene suficiente know-how para construir sistemas a medida de acuerdo con las necesidades especiales de los usuarios. Además de esto, pronto estarán en el mercado sistemas de próxima generación equipados con funciones más generales y amplias. También estamos considerando un sistema de alquiler basado en suscripción para suministrar sistemas actualizados a todos los usuarios.
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Disclosures
El autor no tiene nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio contó con el apoyo de una subvención del Centro de Promoción de Nuevos Negocios, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
References
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