Summary
Burada, otomatik bir hücre kültürü sistemi için bir protokol sunuyoruz. Bu otomatik kültür sistemi, işçiliği azaltır ve indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerin bakımından, çeşitli hücre tiplerine farklılaşmaya kadar, indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerin işlenmesine aşina olmayan araştırmacılar da dahil olmak üzere kullanıcılara fayda sağlar.
Abstract
Sonsuz kendi kendine çoğalma yeteneğine sahip insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler), nadir hastalık patolojilerinin aydınlatılması, yeni ilaçların geliştirilmesi ve hasarlı organları restore etmeyi amaçlayan rejeneratif tıp dahil olmak üzere çok sayıda alanda uygulamaları olması beklenmektedir. Buna rağmen, hiPSC'lerin sosyal uygulaması hala sınırlıdır. Bu kısmen, iPSC'lerin küçük çevresel değişikliklere karşı yüksek duyarlılığı nedeniyle, ileri bilgi ve sofistike teknik becerilerle bile kültürdeki farklılaşmayı yeniden üretmenin zorluğundan kaynaklanmaktadır. Otomatik bir kültür sisteminin uygulanması bu sorunu çözebilir. Bir araştırmacının becerisinden bağımsız olarak yüksek tekrarlanabilirliğe sahip deneyler, çeşitli enstitüler arasında paylaşılan bir prosedüre göre beklenebilir. Daha önce iPSC kültürlerini koruyabilen ve farklılaşmayı indükleyebilen birkaç otomatik kültür sistemi geliştirilmiş olsa da, bu sistemler insanlaştırılmış, çok eklemli robotik kollardan yararlandıkları için ağır, büyük ve maliyetlidir. Yukarıdaki sorunları iyileştirmek için, daha kompakt, daha hafif ve daha ucuz olmasını sağlayan basit bir x-y-z ekseni kayar ray sistemi kullanarak yeni bir sistem geliştirdik. Ayrıca, kullanıcı yeni taşıma görevleri geliştirmek için yeni sistemdeki parametreleri kolayca değiştirebilir. Bir görev oluşturulduktan sonra, kullanıcının tek yapması gereken iPSC'yi hazırlamak, istenen görev için gereken reaktifleri ve sarf malzemelerini önceden sağlamak, görev numarasını seçmek ve zamanı belirtmektir. Sistemin, besleyici hücreler olmadan birkaç geçiş yoluyla iPSC'leri farklılaşmamış bir durumda tutabildiğini ve kardiyomiyositler, hepatositler, nöral progenitörler ve keratinositler dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine farklılaşabildiğini doğruladık. Sistem, yetenekli araştırmacılara ihtiyaç duymadan kurumlar arasında yüksek oranda tekrarlanabilir deneylere olanak tanıyacak ve yeni girişlerin önündeki engelleri azaltarak hiPSC'lerin daha geniş bir araştırma alanı yelpazesinde sosyal olarak uygulanmasını kolaylaştıracaktır.
Introduction
Bu makale, bir firma ile işbirliği yaparak ürettiğimiz insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC) için otomatik bir kültür sistemi için gerçek ve ayrıntılı kullanım prosedürleri sağlamayı ve temsili sonuçları göstermeyi amaçlamaktadır.
Makalenin 2007 yılında yayınlanmasından bu yana, iPSC tüm dünyada dikkat çekmektedir1. En büyük özelliği herhangi bir somatik hücreye farklılaşabilmesi nedeniyle, rejeneratif tıp, inatçı hastalıkların nedenlerinin aydınlatılması ve yeni terapötik ilaçların geliştirilmesi gibi çeşitli alanlarda uygulanması beklenmektedir 2,3. Ek olarak, insan iPSC'den türetilen somatik hücrelerin kullanılması, önemli etik kısıtlamalara tabi olan hayvan deneylerini azaltabilir. iPSC'lerle yeni yöntemler araştırmak için sürekli olarak çok sayıda homojen iPSC'ye ihtiyaç duyulsa da, bunları yönetmek çok zahmetlidir. Ayrıca, iPSC'yi ele almak, ince kültürel ve çevresel değişikliklere karşı bile yüksek hassasiyeti nedeniyle zordur.
Bu sorunu çözmek için, insanlar yerine otomatik kültür sistemlerinin görevleri yerine getirmesi beklenir. Bazı gruplar, hücre bakımı ve farklılaşması için birkaç otomatik insan pluripotent kök hücre kültürü sistemi geliştirmiş ve başarılarını yayınlamıştır 4,5,6. Bu sistemler, çok eklemli robotik kol(lar)ı donatır. Robotik kollar, sadece insan kol hareketlerini yüksek oranda taklit etmeleri bakımından değil, aynı zamanda kol(lar) için daha yüksek maliyet(ler), daha büyük ve daha ağır sistem paketlemeleri ve hedeflenen hareketleri elde etmek için mühendisler tarafından zaman alıcı eğitim çabaları gerektirmeleri bakımından da kusurludur 7,8. Cihazın ekonomik, alan ve insan kaynakları tüketimi noktalarında daha fazla araştırma tesisine tanıtılmasını kolaylaştırmak için, iPSC'nin bakımı ve çeşitli hücre tiplerinefarklılaşması için yeni bir otomatik kültür sistemi geliştirdik 9.
Yeni sistem için gerekçemiz, çok eklemli robotik kollar yerine X-Y-Z eksenli bir ray sistemini benimsemekti9. Robotik kolların karmaşık el benzeri işlevlerini değiştirmek için, bu sisteme üç tür özel işlevsel kol ucunu otomatik olarak değiştirebilen yeni bir fikir uyguladık. Burada, süreç boyunca mühendislerin katkılarına ihtiyaç duyulmaması nedeniyle, kullanıcıların yazılım üzerinde basit siparişlerle nasıl kolayca görev programları yapabileceklerini de gösteriyoruz.
Robotik kültür sistemlerinden biri, farklılaşma için 3D hücre agregaları olarak 96 oyuklu plakalar kullanılarak embriyoid cisimlerin yapımını göstermiştir4. Burada bildirilen sistem 96 oyuklu plakaları işleyemez. Bunlardan biri, bir insan pluripotent kök hücresi olmamasına rağmen, bir hücre hattı kullanarak mevcut iyi üretim uygulaması (cGMP) derecesine ulaştı5. Burada ayrıntıları verilen otomatik kültür sistemi, laboratuvar deneylerine yardımcı olmak amacıyla geliştirilmiştir (Şekil 1). Bununla birlikte, seviye IV güvenlik kabinine eşdeğer temiz seviyeleri tutmak için yeterli sisteme sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kansai Tıp Üniversitesi Etik Komitesi, KMUR001 adlı sağlıklı gönüllü kaynaklı iPSC'lerin üretilmesini ve kullanılmasını onayladı (onay No. 2020197). Açıkça işe alınan donör, resmi bilgilendirilmiş onam verdi ve hücrelerin bilimsel kullanımını kabul etti.
NOT: Mevcut arayüz (Windows XP işletim sistemi altında çalışan "ccssHMI" adlı özel yazılım) temel işlem ekranıdır. Yukarıda belirtilen arayüz altında, kullanıcıların çeşitli işlemleri başlatmasına izin veren bir dizi sekme düzenlenmiştir.
1. Yükleme işlemleri
- Tıkla Yükleniyor yazılımın üst ekranındaki düğmesine basın. Yükleme Hazırlığı Başlat düğmesine tıklayın.
- Aparata girecek tabak(lar)ı veya tabak(lar)ı aparattaki yerlerine yerleştirin.
NOT: Her kapağın üzerine bulaşık tanımlaması için gerekli bilgiler yazılmalıdır. - Ön sürgülü camı manuel olarak kapatın ve mekanik güvenlik onay düğmesine basın.
- Yazılımda tabak(lar)ın veya tabak(lar)ın türünü ve miktarını seçin.
- Yükleme Hazırlığı Tamamlandı düğmesine tıklayın. Yükleme Başlat düğmesine tıklayın.
- Sisteme bir çanak yüklendikten sonra, yazılımda iPS hücreli veya iPS hücresiz gibi çanak üzerindeki bilgileri seçin. Yazılımdaki her yemekle ilgili notları kaydedin.
- Yükleme işlemini tamamlamak için sonundaki Kayıt düğmesine tıklayın.
2. Boşaltma işlemi
- Tıkla Kaldır Yazılımın üst ekranındaki düğmesine basın. Yazılımda kaldırılacak bulaşık(lar)ı seçin.
- Tabak(lar)ı seçtikten sonra, Boşaltma Hazırlığı Başlat düğmesine tıklayın. Boşaltma Başlat düğmesine tıklayın.
- Bulaşık(lar) inkübatörden sistemdeki tezgaha aktarıldıktan sonra Bulaşık Çıkarma düğmesine basın.
- Ön sürgülü pencereyi manuel olarak açın ve bulaşık(lar)ı çıkarın. Ön sürgülü camı manuel olarak kapatın ve mekanik güvenlik onay düğmesine basın.
3. Sarf malzemelerinin takviyesi: pipetler, tüpler ve ortam
- Pipetler, tüpler ve ortam gibi sarf malzemelerini yenilemek için yazılımın üst ekranındaki Sarf Malzemeleri düğmesine tıklayın, ardından yenilenecek öğeyi seçin.
- Pipetler
- Pipet düğmesine tıklayın. Yenile düğmesini seçin.
- Kullanıcının yazılımda yenilemek istediği bir raf seçin. Yenileme Başlat düğmesine tıklayın.
- Tezgah üzerindeki pipet saklama alanının kapağının açıldığını onayladıktan sonra, ön sürgülü pencereyi manuel olarak açın ve gerektiğinde pipetleri doldurun.
- Ön sürgülü camı manuel olarak kapatın ve mekanik güvenlik onay düğmesine basın. Tamamlananları Yenile düğmesini tıklayın.
- Stok Yenileme Kurulumu düğmesini tıklayın ve stok yenileme bilgilerini girin, ardından Kayıt düğmesini tıklayın.
- Tamamlananları Yenile düğmesini tıklayın.
- Tüp
- Tüp düğmesine tıklayın. Yenile düğmesini seçin.
- Kullanıcının yazılımda yenilemek istediği bir raf seçin. Yenileme Başlat düğmesine tıklayın.
- Rafın en üste taşındığını onayladıktan sonra, Tüpü Doldur düğmesine tıklayın.
- Ön sürgülü pencereyi manuel olarak açın ve tüpleri gerektiği gibi doldurun.
- Ön sürgülü camı manuel olarak kapatın ve mekanik güvenlik onay düğmesine basın.
- Tamamlananları Yenile düğmesini tıklayın.
- Stok Yenileme Kurulumu düğmesini tıklayın ve stok yenileme bilgilerini girin, ardından Kayıt düğmesini tıklayın. Kapat düğmesine tıklayın.
- Orta
- Orta düğmesini tıklayın. Yazılımda Yenile düğmesini seçin.
- Kullanıcıların yenilemek istediği üç raftan birini seçin. Yenileme Başlat düğmesine tıklayın.
- Orta depolama alanının kapağının açıldığını onayladıktan sonra, ön sürgülü pencereyi manuel olarak açın ve ortamı doldurun.
- Ön sürgülü camı manuel olarak kapatın ve mekanik güvenlik onay düğmesine basın.
- Tamamlananları Yenile düğmesini tıklayın.
- Yenile düğmesini tıklatın ve ortamın adı ve miktarı da dahil olmak üzere ortamın bilgilerini girin. Gerekirse ek açıklamalar girin.
- Kayıt düğmesine tıklayın.
- Kapat düğmesine tıklayın.
- Pipetler
4. Görev seçimi
- Tıkla Görev Yazılımın üst ekranındaki düğmesine basın.
- Görev Ayarı düğmesini seçin. Görev listesinden istediğiniz görevi seçin ve Sonraki Adım düğmesine tıklayın.
- Görevin gerçekleştirileceği tarih ve saati belirtin ve ardından Kayıt düğmesini tıklatın. Görevi gerçekleştirmek için bir tabak veya tabak seçin ve ardından Kayıt düğmesine tıklayın.
- Seçilen görevi yeniden onayladıktan sonra, Kayıt düğmesine tıklayın. Bir sonraki ekranda görevin kaydedildiğini onaylayın.
- Gerekirse, bir sonraki görevi aynı şekilde ayarlayın.
- Sonunda Başlat düğmesine tıklayın. Ardından, görev belirtilen tarih ve saatte otomatik olarak başlayacaktır.
NOT: Her görevi bitirdikten hemen sonra, UV ışıkları (davlumbazın iki yanında bulunur) otomatik olarak açılır ve 5-30 dakika sonra, yardımcı ayara göre, davlumbazı aseptik durumda tutmak için kapatılır. Durdurmak için, kullanıcılar Başlat düğmesine tıklayabilir. - Kullanıcılar zamanlanmış bir görevi önceden iptal etmek isterse, Durdur düğmesini tıklatın.
- İptal edilecek görevi seçtikten sonra, Görevi Düzenle düğmesine tıklayın.
- Görev İptali düğmesine tıklayın. Bir sonraki ekranda görevin silindiğini onaylayın.
5. Hücre resimlerini kontrol edin
- Her görev, görev çalışmasından önce ve sonra mikroskobik gözlemleri (fotoğraf çekmeyi) içerir. Her görevden önce veya sonra mikroskobik bir fotoğrafçılık görevi ekleyerek hücre kültürünün ilerlemesini fotoğrafik olarak gözlemleyin.
- Zaman içinde aynı konumu izlemek için sabit nokta gözlemi için çanağın veya kuyu plakasının birden fazla belirli konumunun önceden seçilmesi de dahil olmak üzere önceden ayarlanmış görev programlarını seçin.
6. Geçiş ve farklılaşma
- Bölüm 1-5'teki adımları izleyin ve otomatik hücre kültürü sistemini pasaj ve farklılaşma gerçekleştirecek şekilde ayarlayın. Pasaj, kardiyomiyosit farklılaşması, hepatosit farklılaşması, nöral öncü hücre farklılaşması ve keratinosit farklılaşması için cihaz ayarları sırasıyla Tablo 1, Tablo 2, Tablo 3, Tablo 4 ve Tablo 5'te gösterilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin bakımı
Üç hPSC hattı (RIKEN-2F, 253G1 ve KMUR001) kullandık. Günlük manuel olarak gerçekleştirilen deneylerle bakım protokolünü optimize ettik ve sistem tarafından gerçekleştirilen yedi ön deney aracılığıyla ayrıntılı programları daha da optimize ettik. Örneğin, insanlar tarafından kullanılan farklı pipetlerden ve sistemden çıkan tükürük akışının sıvı hızlarının neden olduğu kayma gerilmeleri oldukça farklıdır; Bu nedenle, enzimatik parçalamanın zaman uzunluğunu ve sistem tarafından hücre dispersiyonu için pipetleme sayısını optimize ettik.
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler, 0.5 μg/cm2 hücre kültürü matrisi ile kaplanmış 10 cm'lik bir tabak üzerinde tutuldu. Geçiş için sistem, hiPSC'yi üç kez kalsiyumsuz 5 mL fosfat tampon salin (PBS [-]) ile yıkamak, daha sonra 10 μM Rho kinaz inhibitörü (Y-27632) ile takviye edilmiş 3 mL TrypLE ekspres enzimi ile 37 ° C'de 15 dakika boyunca tedavi etmek üzere programlandı. Bundan sonra, sistem plakaya% 0.15 sığır serum albümin fraksiyonu V (BSA) ile 9 mL PBS (-) ekledi ve 10 mL hücre içeren sıvıyı aspire eden iki hareket seti gerçekleştirdi ve sıvıyı pipet ucundan plaka yüzeyine 20 ° daha yakın eğilen plakanın üst kısmı boyunca zikzak bir hareketle dağıttı, ve plaka karşı tarafta 20° eğik olarak yukarıdaki işlem sırasını tekrarladı. Daha sonra sistem, hücre içeren ortamı 15 mL'lik bir tüpte topladı ve kapattı, ardından hücreleri biriktirmek için 5 dakika boyunca 115 x g'de santrifüjlendi. Daha sonra, sistem süpernatanı aspire etti ve hücre peletini 10 kez pipetleyerek 10 μM Y-27632 ile 10 mL kültür ortamı kullanarak tek hücrelere dağıttı. Sistem, 1 mL tripan mavisi çözeltisini 15 mL'lik yeni bir tüpe aktardı, ardından 1 mL hücre süspansiyonu ekledi ve beş kez pipetleyerek karıştırdı. Bundan sonra, 100 μL Tripan mavi lekeli hücre çözeltisi aspire edildi ve tutucudaki tek kullanımlık hemositometrenin giriş penceresine dağıtıldı. Sistem, hemositometre tutucusunu mikroskobik gözlem alanına taşıdı ve hemen yazılım tarafından analiz edilen bir fotoğraf çekti ve elde edilen hücre konsantrasyonu bir sonraki adıma uygulandı. iPSC bakımı için sistem, hücreleri 15.000 hücre/cm2 hücre yoğunluğunda, 0,5 μg/cm2 hücre kültürü matrisi ile kaplanmış yeni 10 cm çapında plastik plakalara yerleştirdi. Farklılaşma deneyleri için sistem, 1/100'e seyreltilmiş bir hücre kültürü matrisi ile kaplanmış 6 oyuklu plakalarda her bir somatik hücre tipi için hazırlanan ortamda gerekli hücre yoğunluğunda hücreleri tohumladı. Son olarak, sistem plakaları inkübatöre aktarmadan önce beş kez çapraz kilitleme gerçekleştirdi. iPSC'leri içeren üç yeni 10 cm'lik plaka ve üç hücre kültürü matrisi önceden kaplanmış plaka sisteme yüklendi ve diğer gerekli öğeler de yukarıda belirtilen ilgili prosedürlere göre hazırlandı. Bir bakım kültürü döngüsü, 1. günde bir geçiş görevinden ve ardından 3 gün boyunca günde bir kez kültür ortamı değişikliğinden oluşur. Deney boyunca, bu döngü beş döngü için kuruldu. Ek olarak, sarf malzemeleri sırayla yenilendi.
Sipariş edilen programa göre, sistem tarafından planlandığı gibi beş döngü bakım kültürü başarıyla gerçekleştirildi. Her görev sırasında otomatik olarak çekilen hücre fotoğraflarından, hücrelerin zaman içinde sorunsuz bir şekilde çoğaldığı doğrulandı. Hücre genişlemesi (n = 3) hesaplandı ve Şekil 2'de gösterildi. Otomatik kültür sisteminde iPSC'lerin farklılaşmamış durumunun i-iIA kültüründen sonra bile değişmeden kalıp kalmadığını doğrulamak için, her geçişte kalan numuneler kullanılarak immünositometorik analiz (Oct3/4 ve SSEA4) yapıldı (Şekil 3A). Ayrıca, beş döngüden sonra, üç çanak sistemden boşaltıldı ve immünohistokimyasal analiz (Oct3/4, SSEA4 ve Tra1-81) de yapıldı (Şekil 3B). Floresan immün boyama kullanılarak yapılan her iki analiz, iPS hücrelerinin farklılaşmamış durumunun korunduğunu gösterdi. iPSC'lerin karyotiplemesi de otomatik bir kültür sisteminde bakım kültüründen önce ve sonra gerçekleştirildi. Bakım kültürünün başlamasından önce kromozom 17'nin bir alelinde bir anormallik gözlenmesine rağmen, anormallik de dahil olmak üzere 5 idame kültüründen sonra sistem tarafından belirli bir değişiklik gözlenmedi (Şekil 3C). iPSC'lerin bakımı için kullanılan ayarlar Tablo 1'de özetlenmiştir.
Farklılaştırma
Kardiyomiyositler
Önceki bir yayından farklılaşma protokolü burada takip edildi10. Sistem, farklılaşmamış hiPSC'leri (KMUR001) 30.000 hücre/cm2 yoğunlukta, 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş hiPSC kültür ortamında hücre kültürü matrisi kaplı 6 oyuklu plakalara ekti. Sistem, 3 gün sonra 6 μM GSK-3ß inhibitörü CHIR-99021, 20 ng/mL Aktivin A ve 10 ng/mL BMP4 ile ortamı insan pluripotent kök hücre ortamına değiştirdi (farklılaşma günü 1). Farklılaşma günü 3'te, sistem CDM3 ortamına geçti: RPMI 1640, 500 μg / mL rekombinant insan albümini ve 2 μM Wnt-C59 ile 213 μg / mL L-askorbik asit 2-fosfat. Farklılaşma 5. günde, sistem yeni CDM3 ortamına geçti; daha sonra, her gün yeni CDM3 ortamına geçmeyi tekrarladı. iPSC'lerin kardiyomiyosit farklılaşması için kullanılan ayarlar Tablo 2'de özetlenmiştir.
Hepatositler
Burada önceki bir yayından farklılaşma protokolü izlenmiştir11. Sistem, farklılaşmamış hiPSC'leri (RIKEN2F) 25.000 hücre/cm2 yoğunlukta, 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş hiPSC kültür ortamında hücre kültürü matrisi kaplı 6 oyuklu plakalara ekti. 2 gün sonra (farklılaşma günü 1), sistem ortamı RPMI-1640 artı 27 ng / mL Aktivin A, 27 μM CHIR-100 ve% 27 glutamin takviyesi içeren 100 ng / mL B6 Eksi İnsülin (RPMI-B99021) olarak değiştirdi (ör., GlutaMAX) 24 saat boyunca. Farklılaşma günü 2'de, ortamı 50 ng/mL Aktivin A ile RPMI-B27 olarak değiştirdik. Farklılaşma günü 5'te sistem, ortamı %1 glutamin takviyesi ve 10 ng/mL BMP-4 içeren RPMI-B27 olarak değiştirdi. Farklılaşma günü 9'da, sistem ortamı hepatosit olgunlaşma ortamına değiştirdi: Leibovitz'in L-15 ortamı% 8.3 triptoz fosfat suyu, 10 μM hidrokortizon 21-hemisüksinat, 50 μg / mL sodyum L-askorbat, 100 nM deksametazon,% 0.58 insülin-transferrin-selenyum, 2 mM glutamin takviyesi,% 8.3 fetal sığır serumu ve 100 nM rac-1,2-diheksadesilgliserol içerir. Daha sonra sistem, ortamı her gün yeni bir ortamla değiştirmeyi tekrarladı. iPSC'lerin hepatosit farklılaşması için kullanılan ayarlar Tablo 3'te özetlenmiştir.
Nöronal öncü hücreler
Burada önceki bir yayından farklılaşma protokolü izlenmiştir12. Sistem, farklılaşmamış hiPSC'leri (RIKEN2F) 25.000 hücre/cm2 yoğunlukta, Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyeri (DMEM)/F12 ve nörobazal besiyerinde (1:1) bazal membran matris kaplı 6 oyuklu plakalar üzerine ekti, %10 Knockout serum replasmanı, 0.1 mM esansiyel olmayan amino asitler, 10 μM TGF-beta reseptör inhibitörü (SB431542) ile 1 mM glutamin takviyesi, 10 μM BMP sinyal inhibitörü (dorsomorfin), ve 10 μM Y-27632 (farklılaşma günü 1). Farklılaşma günü 5'te, sistem ortamı DMEM / F12 ve Nörobazal ortam 1: 1 olarak değiştirdi 0.1mM esansiyel olmayan amino asitler, 1 mM glutamin takviyesi,% 1 N-2 takviyesi,% 1 B-27 takviyesi, 50 μg / mL askorbik asit 2-fosfat, 10 μM SB431542 ve 10 μM dorsomorfin. Farklılaşma günü 9'da, sistem ortamı DMEM / F12 ve nörobazal ortam 1: 1 olarak değiştirdi 0.1 mM esansiyel olmayan amino asitler, 1 mM glutamin takviyesi,% 1 N-2 takviyesi,% 1 B-27 takviyesi, 50 μg / mL askorbik asit 2-fosfat ve 1 μM all-trans retinoik asit. Farklılaşma günü 13-16'da, sistem ortamı her gün DMEM / F12 ve 0.1 mM esansiyel olmayan amino asitler, 1 mM glutamin takviyesi,% 1 N-2 takviyesi,% 1 B-27 takviyesi, 50 μg / mL askorbik asit 2-fosfat ve 10 ng / mL bFGF ve 10 ng / mL EGF ile desteklenmiş nörobazal ortam 1: 1 ile değiştirdi. iPSC'lerin nöral öncü hücre farklılaşması için kullanılan ayarlar Tablo 4'te özetlenmiştir.
Keratinositler
Burada önceki bir yayından farklılaşma protokolü izlenmiştir13. Sistem, farklılaşmamış hiPSC'leri (253G1) 15.000 hücre/cm2 yoğunlukta, 10 μM Y-27632 ile hiPSC kültür ortamında hücre kültürü matrisi kaplı 6 oyuklu plakalara ekti. 2 gün sonra (farklılaşma günü 1), sistem ortamı Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM) / F12 ve 0.1 mM esansiyel olmayan amino asitler, 1 mM glutamin, 55 μM 2-merkaptoetanol, %1 N-2 takviyesi, %2 B-27 takviyesi, 50 μg/mL askorbik asit 2-fosfat, %0.05 sığır serum albümini ve 100 ng/mL FGF-bazik. Farklılaşma günü 3'te ve daha sonra, ortam, 0.5 μg / mL hidrokortizon, 1 μM all-trans retinoik asit, 25 ng / mL hBMP-4, 2.4 μg / mL adenin, 1.37 ng / mL triiyodotironin, 0.3 mM askorbik asit 2-fosfat ilavesiyle insan keratinosit ortamına (3. gün için takviye olmadan ve 5. günde / sonrasında bir takviye ile) değiştirildi, ve 2 μM forskolin, sistem tarafından her 2 günde bir. iPSC'lerin keratinosit farklılaşması için kullanılan ayarlar Tablo 5'te özetlenmiştir.
Yukarıda bahsedildiği gibi, tüm süreç, iPS hücrelerinin tohumlanmasından sonraki farklılaşma protokolleri serisine kadar yalnızca otomatik kültür ekipmanı kullanılarak gerçekleştirildi. Her hücredeki karakteristik belirteçlerin ekspresyonu değerlendirildi (Şekil 4). Farklılaşmanın sadece otomatik bir kültür sistemi kullanılarak indüklenebileceği gösterilmiştir.
Şekil 1: Otomatik kültür sisteminin özeti. (A) Boyut ve yerleşim krokisini gösteren sistem resmi 1. (B) Tezgahın resmi ve yerleşim krokisi 2. (C) El aletleri: çanak, tüp ve pipet. Bu rakam Bando ve ark.9'un izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Geçiş görevi ve hücre büyümesi. (A) Kare her işlemi gösterir. (B) Üç bağımsız deneydeki her otomatik hücre sayımı kullanılarak hesaplanan iPSC genişlemesi. (C) Pasajdan pasaja otomatik olarak yakalanan temsili görüntüler. Ölçek çubukları = 400 μm ve 100 μm (iç). Bu rakam Bando ve ark.9'un izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: iPSC'nin otomatik uzun süreli bakımı. (A) Oct-3/4 ve SSEA-4 için üç bağımsız deneyin tüm immünositometrikik analizleri. Her mavi histogram, primer antikor kontrolü olmadığını gösterir. Her kırmızı histogram, belirtilen antijene özgü sinyali temsil eder. (B) Oct-3/4, SSEA-4 ve Tra 1-81 için immünohistokimyasal olarak boyanmış hücrelerin temsili görüntüleri. Ölçek çubukları = 50 μm. (C) Beşinci geçişten sonra RIKEN2F-iPSC'nin karyotipi. Bu rakam Bando ve ark.9'un izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İmmünohistokimyasal boyama. Hepatositlerin (Skala çubukları = 100 μm), kardiyomiyositlerin (Skala çubukları = 100 μm), nöronal progenitör hücrelerin (Skala çubukları = 100 μm) ve keratinositlerin (Skala çubukları = 200 μm) immünohistokimyasal resimleri. Bu rakam Bando ve ark.9'un izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Geçiş hazırlıkları ve sistem ayarları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 2: Kardiyomiyosit farklılaşma preparatları ve sistem ayarları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 3: Hepatosit farklılaşma preparatları ve sistem ayarları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 4: Nöral öncü hücre farklılaşma preparatları ve sistem ayarları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 5: Keratinosit farklılaşma preparatları ve sistem ayarları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokoldeki kritik bir adım, bir kullanıcı herhangi bir hata bulursa, herhangi bir zamanda iptal, durdur veya sıfırla düğmesine tıklaması ve ilk adımdan baştan başlamasıdır. Yazılım, çifte rezervasyon, sistem görevleri etkinken kapıların açılması ve ikmal eksikliği dahil olmak üzere insan hatalarından kaçınabilir. İstenilen somatik hücreye başarılı ve verimli bir şekilde farklılaşmak için bir diğer kritik nokta, pluripotent kök hücre hatlarının uygun seçimidir, çünkü her pluripotent kök hücrenin farklılaşma özelliklerinde kontrol edilemez bir önyargıvardır 14,15.
İndüklenmiş pluripotent kök hücreler için bu otomatik kültür sistemi, onları çeşitli somatik hücre tiplerine göre koruyabilir ve farklılaştırabilir. Bu sistemin boyutu 200 cm (genişlik), 110 cm (derinlik) ve 233 cm (yükseklik) olup, toplam ağırlığı 1,2 tondur. Cihaza yerleştirilen inkübatör, aynı anda otuz altı adet 10 cm'lik tabak ve dokuz adet çok kuyulu plaka tutabilir.
Önceki modellere göre iyileştirmeler, ilk olarak, bir taşıma kolu olarak, X-Y-Z-ekseni ray sisteminin, kolun uç aletini bulaşıklar, tüpler ve pipetler için üç farklı parçaya değiştirerek çalışan 6 eksenli mafsallı bir koldan yeni dönüştürülmesidir. Kol, sistemin tavanından sarkıtılır ve X-Y-Z ekseni boyunca hareket eder. İkinci olarak, besleyicisiz bakım kültürleri ve geçişten sürekli olarak gerçekleştirilen farklılaşma indüksiyon protokolleri için bir hücre sayma sistemi tanıtıldı. Tek hücreli süspansiyon çözeltisi tripan mavisi çözeltisi ile karıştırıldıktan sonra, mikroskobik gözlem ve görüntüleme için tek kullanımlık bir hemositometreye aktarıldı. Yazılım, canlı hücre sayısını saymak ve gerekli sayıda hücreyi tohumlamak için gereken hacmi hesaplamak için elde edilen görüntüyü otomatik olarak analiz eder. Bu görüntü analizi ile elde edilen hücre sayımlarının doğruluğu, manuel olarak elde edilenlerle tutarlıydı.
X-Y-Z-eksenleri ray sistemi, her görevi önceki versiyondan daha hızlı yerine getirmek için uygulandı (çok eksenli mafsallı kol). Bu otomatik kültür sistemi ile 16 gün boyunca beş sürekli geçiş gerçekleştirildi ve iPSC'ler 625 ± 93 kat genişletildi. Besleyici hücreler olmadan hücre bakımı süresi için dayanıklılık kanıtı, besleyici hücrelerle önceki gösterimizden daha kısa olmasına rağmen, hücre genişlemesi önceki gösterime kıyasla daha verimliydi6. Kısaltılmış görev süresi, görevler sırasında hücre hasarının kurumasını önlemeye katkıda bulunuyor gibi görünüyordu.
Ayrıca, idame kültüründen kardiyomiyositlere, hepatositlere, nöronal öncü hücrelere ve keratinositlere farklılaşmaya kadar olan farklılaşma görevleri insan müdahalesi olmadan gerçekleştirildi. Bu kursların bir serisinden sonra, tek başına otomatik kültür sisteminde elde edilen hücrelerin istenen hücrelere farklılaştığı floresan immün boyama ile doğrulandı. Bu nedenle, bir görev programını paylaşarak ve bu sistemi kullanarak, iPS hücre yönetimine aşina olmayan araştırmacılar, kendi araştırmaları için iPSC türevi somatik hücreler elde edebilirler. Ayrıca, araştırmacılar veya tesisler arasındaki tekrarlanabilirlik farklılıkları mümkün olduğunca ortadan kaldırılabilir ve her seferinde homojen kalitede hücrelerin elde edilmesini sağlayabilir.
Yeni bir ray sistemi benimsenerek, ekipman küçültülebilir ve ağırlığı öncekinden ~ 200 kg daha hafif olan 1,2 tona düşürülebilir. Ayrıca, parça ve program ayar maliyetleri yaklaşık 10.000 ABD doları azaltılabilir. Bakım ve programlama maliyetlerinin %13 oranında düşeceği tahmin ediliyor. Daha fazla araştırmacıyı iPS hücresi ile ilgili araştırmalara kolayca girmeye motive etmek için, ekipman maliyetlerini düşük tutmak da önemlidir6. Mevcut ve yeni nesil otomatik kültür sistemlerinin, iPSC'lerin ve iPSC'den türetilen farklılaşmış hücrelerin daha homojen kalitede sağlanmasına yardımcı olan katkılardan biri olacağını umuyoruz.
Bu sistemin başlıca sınırlamaları, buzdolabının kültürlerin geçici olarak depolanması için sınırlı kapasitesi ve küçük miktarlarda (<100 μL) sıvının işlenmesindeki zayıflığıdır. Ayrıca, gelişmiş yapay zekanın olmaması, zamanında hücre durumuna göre otomatik optimizasyonu devre dışı bırakır. Küçük sınırlama, sistem üreticileritarafından sağlanan özel pipet uçlarının gerekliliğidir 4,5. Orta preparatlar için az miktarda sıvıyı işleyebilecek ve yüksek performanslı yapay zekaya (sistem öğrenmesi) dayalı bir geri bildirim optimizasyon sistemi içerecek yeni nesil kültür sistemleri geliştiriyoruz. İşbirliği yapan üreticimiz9, kullanıcıların özel ihtiyaçlarına göre ısmarlama sistemler oluşturmak için yeterli bilgi birikimine sahiptir. Buna ek olarak, daha genel ve daha geniş fonksiyonlarla donatılmış yeni nesil sistemler de yakında piyasada olacak. Ayrıca, tüm kullanıcılara güncel sistemler sağlamak için abonelik tabanlı bir kiralama sistemi düşünüyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarın ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japonya'daki Yeni İş Geliştirme Merkezi'nden alınan bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
References
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
- Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
- Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
- Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647 (2015).
- McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
- Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41 (2017).
- Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).
- Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
- Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
- International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).
