Summary
Hier beschrijven we een in-house extracellulaire vesikel weefselfactoractiviteitstest. Op activiteit gebaseerde assays en op antigeen gebaseerde assays zijn gebruikt om de weefselfactor te meten in extracellulaire blaasjes van menselijke plasmamonsters. Op activiteit gebaseerde assays hebben een hogere gevoeligheid en specificiteit dan op antigeen gebaseerde assays.
Abstract
Weefselfactor (TF) is een transmembraanreceptor voor factor (F) VII en FVIIa. Het TF/FVIIa-complex initieert de stollingscascade door zowel FIX als FX te activeren. TF komt vrij uit cellen in de bloedsomloop in de vorm van extracellulaire blaasjes (EV's). Het niveau van TF-positieve (+) EV's is verhoogd bij verschillende ziekten, waaronder kanker, bacteriële en virale infecties en cirrose, en wordt geassocieerd met trombose, gedissemineerde intravasculaire coagulatie, ernst van de ziekte en mortaliteit. Er zijn twee manieren om TF+ EV's in plasma te meten: antigeen- en activiteitsgebaseerde assays. Gegevens geven aan dat op activiteit gebaseerde assays een hogere gevoeligheid en specificiteit hebben dan op antigeen gebaseerde assays. Dit artikel beschrijft onze interne EVTF-activiteitstest op basis van een tweetraps FXa-generatietest. FVIIa, FX en calcium worden toegevoegd aan de TF+ EV-bevattende monsters om FXa te genereren in de aan- en afwezigheid van anti-TF-antilichamen om TF-afhankelijke FXa-generatie te onderscheiden van TF-onafhankelijke FXa-generatie. Een chromogeen substraat dat door FXa wordt gesplitst, wordt gebruikt om het FXa-niveau te bepalen, terwijl een standaardcurve gegenereerd met een gerelipideerde recombinante TF wordt gebruikt voor de bepaling van de TF-concentratie. Deze interne EVTF-activiteitstest heeft een hogere gevoeligheid en specificiteit dan een commerciële TF-activiteitstest.
Introduction
De bloedstolling wordt geïnitieerd met de binding van factor (F) VII/VIIa aan weefselfactor (TF)1. Het TF/FVIIa-complex activeert zowel FIX als FX om de bloedstolling te activeren1. Er zijn twee vormen van membraangebonden TF over de volledige lengte: versleuteld en actief. Daarnaast is er een alternatief gesplitste vorm van TF (asTF). Sfingomyeline en fosfatidylcholine in het buitenste blad van het celmembraan houden TF in een gecodeerde toestand 2,3,4. Wanneer cellen worden geactiveerd of beschadigd, brengt fosfolipide-scramblase fosfatidylserine en andere negatief geladen fosfolipiden over naar de buitenste blaadje1. De activering van cellen resulteert ook in de translocatie van zuur sfingomyelinase naar de buitenste blaad, waar het sfingomyeline afbreekt tot ceramide5. Deze twee mechanismen zetten versleutelde TF om in de actieve vorm. Er wordt ook voorgesteld dat eiwitdisulfide-isomerase de vorming van disulfidebindingen tussen Cys186 en Cys209 in gecodeerde TF bemiddelt, wat resulteert in de de-encryptie van TF 6,7,8. asTF is ook aanwezig in de bloedsomloop, maar mist het transmembraandomein en is daarom oplosbaar 9,10. Belangrijk is dat asTF zeer lage niveaus van procoagulantia-activiteit heeft in vergelijking met actieve TF10,11 over de volledige lengte.
Extracellulaire blaasjes (EV's) komen vrij uit rustende, geactiveerde en stervende gastheercellen, evenals kankercellen12. EV's brengen eiwitten tot expressie uit hun oudercellen12. Actieve TF-dragende EV's komen vrij uit geactiveerde monocyten, endotheelcellen en tumorcellen in de bloedsomloop 13,14,15. Niveaus van TF in plasma kunnen worden gemeten door middel van activiteits- en antigeengebaseerde assays. Op antigeen gebaseerde assays omvatten ELISA en flowcytometrie16. Er zijn twee verschillende op activiteit gebaseerde tests: één- en tweetraps TF-activiteitstests. De eentrapstest is gebaseerd op een op plasma gebaseerde stollingstest. Het TF-bevattende monster wordt aan plasma toegevoegd en de tijd om een stolsel te vormen wordt gemeten na herverkalking. De tweetrapstest meet FXa-generatie van monsters door FVII of FVIIa, FX en calcium toe te voegen. FXa-niveaus worden bepaald met behulp van een substraat dat door FXa wordt gesplitst.
In zowel de een- als de tweetraps TF-activiteitsassays wordt de TF-concentratie bepaald met behulp van een standaardcurve die wordt gegenereerd met recombinant TF. Tweetrapstesten hebben een hogere sensitiviteit en specificiteit dan de eentrapstest. Veel onderzoeken hebben bevestigd dat op activiteit gebaseerde assays een hogere gevoeligheid en specificiteit hebben dan op antigeen gebaseerde assays 17,18,19,20,21. Bovendien heeft onze interne activiteitstest een hogere sensitiviteit en specificiteit dan een commerciële activiteitstest22. Gezonde personen hebben zeer lage of niet-detecteerbare niveaus van EVTF-activiteit in plasma. Daarentegen hebben personen met pathologische aandoeningen, zoals kanker, cirrose, sepsis en virale infectie, detecteerbare niveaus van EVTF-activiteit en dit wordt geassocieerd met trombose, gedissemineerde intravasculaire coagulatie, ernst van de ziekte en mortaliteit 23,24,25,26,27,28. Hier zullen we deze interne tweetraps EVTF-activiteitstest beschrijven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het onderzoek werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de University of North Carolina in Chapel Hill (protocolnummer: 14-2108).
1. Bloedafname bij donoren
- Verzamel volbloed met behulp van een schone venapunctie in de antecubitale ader met een naald van 21 G. Gooi de eerste 3 ml bloed weg, omdat dit deel van het bloed TF van perivasculaire cellen kan bevatten.
- Zuig 2,7 of 1,8 ml (afhankelijk van de grootte van de buisjes) bloed op in een vacutainer met 3,2% natriumcitraat (0,109 mol/l). Vul de buizen niet te veel of te weinig in. Keer de buisjes onmiddellijk na bloedafname voorzichtig om om het natriumcitraat te dispergeren.
- Vermijd roeren als de buizen vóór de verwerking worden getransporteerd. Bereid plasma binnen 2 uur na bloedafname.
2. Bereiding van negatief controleplasma
OPMERKING: Monsters mogen op geen enkel moment vóór de definitieve bevriezing op ijs worden geplaatst.
- Bereid negatief controleplasma met volbloed van gezonde vrijwilligers. Bereid onmiddellijk na bloedafname bloedplaatjesvrij plasma als volgt.
- Breng bloedmonsters over van de vacutainerbuisjes naar buisjes van 15 ml.
- Centrifugeer bloedmonsters bij 2.500 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (20-24 °C) zonder rem.
- Breng het supernatans (bloedplaatjesarm plasma) over in een nieuwe buis en herhaal het centrifugeren onder dezelfde omstandigheden.
- Breng het supernatans (bloedplaatjesarm plasma) over in een nieuw buisje.
- Aliquot het monster in aliquots van ≥100 μl. Laat ongeveer 100 μL op de bodem van de buis liggen.
- Vries het bloedplaatjesarme plasma onmiddellijk in bij −80 °C (Figuur 1).
3. Bereiding van plasma met positieve controle
OPMERKING: De respons op lipopolysaccharide varieert van persoon tot persoon.
- Breng bloedmonsters van de vacutainers over naar buisjes van 15 ml.
- Bereid plasma voor positieve controle met volbloed van gezonde vrijwilligers gestimuleerd met lipopolysaccharide (LPS) van Escherichia coli O111:B4 (10 μg/ml) gedurende 5 uur bij 37 °C met agitatie.
- Volg na 5 uur incubatie de stappen 2.1.2 tot en met 2.1.6.
4. Isolatie van extracellulaire blaasjes uit plasma
NOTITIE: EV-pellets zijn mogelijk niet zichtbaar. De ontdooitijd is afhankelijk van het monstervolume, maar we ontdooien gewoonlijk 100 μL plasma gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Ontdooi plasmamonsters bij 37 °C.
- Voeg 1 ml HBSA zonder calciumbuffer [HBSA-Ca(-)] buffer [137 mM NaCl, 5,38 mM KCl, 5,55 mM glucose, 10 mM HEPES, 0,1% (w/v) runderserumalbumine] toe aan elk 100 μL plasmamonster in een buisje van 1,5 ml.
- Centrifugeer plasmamonsters bij 20.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
- Zuig het supernatans op tot 20 μL zonder de EV-pellet te verstoren.
- Reconstitueer de EV-pellet door 1 ml HBSA-Ca(-)-buffer toe te voegen aan elke buis, pipetteer op en neer op de plaats van de EV-pellet en draai elke buis voor de tweede keer bij 20.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
- Zuig het supernatans op tot 20 μL zonder de EV-pellet te verstoren.
- Reconstitueer de EV-pellet in 80 μL HBSA-Ca(-) en pipetteer op en neer op de plaats van de EV-pellet (figuur 2).
5. Optie: Isolatie van kleine extracellulaire blaasjes met behulp van ultracentrifuge
- Vang na stap 4.3 het supernatans op en ultracentrifugeer het gedurende 70 minuten bij 4 °C bij 100.000 × g .
- Zuig het supernatans op tot 20 μL zonder de EV-pellet te verstoren.
- Reconstitueer de EV-pellet door 1 ml HBSA-Ca(-)-buffer toe te voegen aan elke buis en draai elke buis voor de tweede keer te ultracentrifugeren bij 100.000 × g gedurende 70 minuten bij 4 °C.
- Zuig het supernatans op tot 20 μL zonder de EV-pellet te verstoren.
- Reconstitueer de EV-pellet in 80 μL HBSA-Ca(-).
6. Meting van de activiteit van extracellulaire vesikelweefselfactoren
OPMERKING: EV-monsters moeten goed worden gepipetteerd en gewerveld om te mengen voordat ze aan putten worden toegevoegd. EDTA-dinatrium remt het vermogen van FXa om het chromogene substraat te splitsen. Daarom kan EDTA-dinatrium niet worden gebruikt als vervanging voor EDTA-tetranatrium in stap 6.7.
- Voeg 40 μL van een EV-monster toe aan twee putjes van een plaat met 96 putjes.
- Voeg 11 μl van een remmend antihumaan TF-IgG bij muizen [(36,4 μg/ml, eindconcentratie 7,8 μg/ml)] toe aan een putje van een EV-monster en 11 μl controlemuis-IgG [(36,4 μg/ml, eindconcentratie 7,8 μg/ml)] aan het andere putje.
- Incubeer de plaat met 96 putjes gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Bereid tijdens de incubatietijd 50 μL/putje TF-standaarden (0, 0,32, 0,63, 1,25, 2,5, 5, 10 en 20 pg/ml) in tweevoud met behulp van gerelipideerde recombinant TF.
- Bereid het factormengsel door 4 ml HBSA te mengen met calcium [HBSA-Ca(+)] [HBSA-Ca(-) + 10 mM CaCl2, eindconcentratie 10 mM], 800 μL 900 nM FX in HBSA-Ca(+) (eindconcentratie: 146,4 nM) en 120 μL 200 nM FVIIa in HBSA-CA(+) (eindconcentratie: 4,8 nM).
- Voeg 50 μl van de factormixoplossing toe aan elk putje, bedek de plaat met folie en incubeer gedurende 2 uur in een incubator bij 37 °C.
- Stop na 2 uur de productie van FXa door 25 μL HBSA-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-buffer [HBSA-Ca(-) + 25 mM EDTA-tetranatrium, eindconcentratie 5 mM] toe te voegen en gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te incuberen.
- Reconstitueer het chromogene substraat dat door FXa wordt gesplitst tot 4 mM (voeg 8,7 ml gedestilleerd water toe aan een injectieflacon van 25 mg).
- Voeg 25 μL van de chromogene substraatoplossing toe aan elk putje, bedek de plaat met folie en vervolgens met aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen, en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.
- Verwijder na 15 minuten incubatie de luchtbellen met een naald of door centrifugeren bij 1.500 × g gedurende 1 minuut.
- Lees de plaat af bij 405 nm met behulp van een plaatlezer met één mengsel voordat u gaat lezen.
- Converteer de FXa-generatie van elk putje naar TF-activiteit met behulp van de standaardcurve die wordt gegenereerd met behulp van gerelipideerde recombinant TF.
- Bereken TF-afhankelijke FXa-generatie (EVTF-activiteit) met behulp van vergelijking (1):
TF-afhankelijke FXa-generatie (EVTF-activiteit [pg/ml]) = Totale FXa-generatie (controleer IgG-put) - TF-onafhankelijke FXa-generatie (anti-TF IgG-put) (Figuur 3) (1)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een succesvol resultaat geeft een positieve controlewaarde van ≥0,5 pg/ml en een negatieve controlewaarde van <0,5 pg/ml. Het is het beste om een hoge LPS-responder te vinden met >1,0 pg/ml EVTF-activiteit voor een positieve controle. Het representatieve resultaat toont de EVTF-activiteit van EV's geïsoleerd uit plasma uit het volbloed van 11 gezonde donoren, met en zonder LPS-activering (Figuur 4). Zes van de elf donoren (donoren 2, 4, 5, 8, 10, 11) waren gemiddelde tot hoge LPS-responders, terwijl vijf van de elf donoren (donoren 1, 3, 6, 7, 9) lage LPS-responders waren.
Figuur 1: Bereiding van bloedplaatjesarm plasma. De figuur is aangepast van Hisada en Mackman29. Afkorting: PDP = bloedplaatjesarm plasma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Isolatie van extracellulaire blaasjes uit bloedplaatjesarm plasma. De figuur is aangepast van Hisada en Mackman29. Afkortingen: PDP = bloedplaatjesarm plasma; EV's = extracellulaire blaasjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Meting van de activiteit van extracellulaire blaasjesweefselfactor. De figuur is aangepast van Hisada en Mackman29. Afkortingen: TF = weefselfactor; EV's = extracellulaire blaasjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: EVTF-activiteit van plasma uit volbloed van 11 gezonde donoren, met en zonder LPS-activering. LPS-activering werd uitgevoerd onder dezelfde omstandigheden als de positieve controle. De positieve controle was afkomstig van een bekende LPS-responder, terwijl de respons op LPS van 11 gezonde donoren niet bekend was op het moment van het experiment. Witte en zwarte balken geven respectievelijk met en zonder LPS-activering aan. Afkortingen: EVTF = extracellulaire vesikel weefselfactor; LPS = lipopolysaccharide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Een samenvatting van de studies waarin deze interne EVTF-activiteitstest, een commerciële TF-ELISA en een activiteitstest worden vergeleken. Afkortingen: EVTF = extracellulaire vesikel weefselfactor; ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt het protocol van onze interne EVTF-activiteitstest gepresenteerd. Er zijn drie cruciale stappen in het protocol. Bij het reconstitueren van de EV-pellet is het belangrijk om op en neer te pipetten op de plaats van de EV-pellet, zelfs als deze niet zichtbaar is. Onvolledige reconstitutie van de EV-pellet zal resulteren in een vals-negatief of onderschatting van de EVTF-activiteitswaarden van de monsters. Ten tweede is het gebruik van HBSA-Ca(+) van cruciaal belang in protocolstap 6.5, omdat FXa-generatie niet kan worden gegenereerd zonder calcium. Ten derde is het gebruik van EDTA-tetranatrium maar niet EDTA-dinatrium om de aanmaak van FXa te stoppen van cruciaal belang, omdat dit laatste het vermogen van FXa om het chromogene substraat te splitsen remt.
We raden de volgende opslag- en gebruiksmethode aan voor elk reagens. We slaan de analysebuffers en het gereconstitueerde substraat op bij 4 °C en gebruiken ze herhaaldelijk totdat ze op zijn. Als we niet binnen 2-3 weken zonder substraat komen te zitten, gooien we het weg omdat het geel wordt. We slaan recombinant TF, antilichamen, FVIIa en FX op bij -80 °C en raden aan om aliquots te maken voor één test om een vries-dooicyclus te voorkomen.
In een voorstudie hebben we plasmamonsters 9 uur bij kamertemperatuur laten staan, ze 's nachts bij -80 °C opnieuw ingevroren en de volgende dag de test uitgevoerd. Ter controle ontdooiden we hetzelfde plasma en bevroor het onmiddellijk opnieuw. We ontdekten dat het monster dat 9 uur bij kamertemperatuur was bewaard, een afname van 16% in EVTF-activiteit had in vergelijking met het monster dat onmiddellijk werd ontdooid en opnieuw ingevroren (Hisada en Mackman, niet-gepubliceerde gegevens 2017).
Naast het verschil in respons op LPS, kan het verschil in de concentratie van EV's in plasma van individuele donoren de verschillende EVTF-activiteit van verschillende donoren verklaren. We hebben inderdaad enkele variaties waargenomen in de concentraties van EV's in plasma van LPS-gestimuleerd volbloed (1,9 ± 0,6 × 1010 deeltjes/ml, n = 6, gemiddelde ± standaarddeviatie)30.
Deze interne EVTF-activiteitstest heeft verschillende functies die commerciële tests niet hebben. Ten eerste maakt de test gebruik van een anti-TF-antilichaam om TF-afhankelijke FXa-generatie te onderscheiden van TF-onafhankelijke FXa-generatie. Van drie commerciële activiteitstesten wordt beweerd dat ze de TF-activiteit in plasma meten, maar geen van hen maakt gebruik van anti-TF-antilichamen16. Daarom meten deze commerciële tests alleen de totale FXa-generatie, maar niet de TF-afhankelijke FXa-generatie. Ten tweede gebruiken we 2,4 nM FVIIa (de uiteindelijke concentratie in de reactie) om TF-onafhankelijke FXa-generatie door FVIIa te minimaliseren. Bij een test voor commerciële activiteiten wordt 12 nM FVIIa in de reactie gebruikt, wat een hoge achtergrond22 oplevert. FVIIa activeert inderdaad lineair FX, afhankelijk van de FVIIa-concentratie in afwezigheid van TF31. We hebben de onderzoeken die deze interne EVTF-activiteitstest en commerciële TF ELISA en een activiteitstest vergeleken, samengevat in tabel 1.
Er worden vier responsclassificaties van EVTF-activiteit voor gecitreerd bloedplaatjesarm plasma voorgesteld: nul (0 tot <0,5 pg/ml); zwak (0,5 tot <1,0 pg/ml), matig (1,0 tot <2,0 pg/ml) en sterk (≥2,0 pg/ml)23. Met name verschillende anticoagulantia beïnvloeden de resultaten van EVTF-activiteitstests. Er werden bijvoorbeeld hogere niveaus van EVTF-activiteit waargenomen bij gebruik van heparine na LPS-stimulatie in vergelijking met natriumcitraat (Donor A: 4,6 (citraat) versus 28,6 (heparine) pg/ml en Donor B: 3,4 (citraat) versus 26,0 (heparine) pg/ml, respectievelijk Hisada en Mackman ongepubliceerde gegevens 2017). Daarentegen werden lagere niveaus van EVTF-activiteit waargenomen bij gebruik van EDTA na LPS-stimulatie in vergelijking met natriumcitraat (Donor C: 3,9 (citraat) versus 1,4 (EDTA) pg/ml, Donor D: 3,8 (citraat) versus 0,4 (EDTA) pg/ml, respectievelijk Tatsumi en Mackman ongepubliceerde gegevens 2016). Deze resultaten geven aan dat de EVTF-activiteitsgegevens niet vergelijkbaar zijn wanneer verschillende anticoagulantia worden gebruikt.
Er zijn een paar beperkingen aan de methode. De variatiecoëfficiënt (CV) is relatief hoog in vergelijking met klinische testen. Inderdaad, het CV voor de positieve controle in zeven onafhankelijke onderzoeken was 24%17,29. Isolatie van EV's met behulp van centrifugatiepellets, niet alleen EV's, maar ook cellulair afval. We analyseerden eerder de pellet van bloedplaatjesrijk plasma door middel van transmissie-elektronenmicroscopie en observeerden bloedplaatjes, EV's en cellulair afval32. We gebruiken een rotor met een vaste hoek en hebben nog geen uitzwenkbare rotor meegemaakt voor centrifugeren van 20.000 × g. We hebben onlangs ontdekt dat kleine EV's die kunnen worden gepelleteerd met 100.000 × g, maar niet met 20.000 × g, EVTF-activiteit hebben bij patiënten met alvleesklierkanker en COVID-1930. Dit geeft aan dat dit protocol geen EVTF-activiteit meet van kleine EV's, zoals exosomen. Met name exosomen zijn sfingomyeline-rijke EV's en de aanwezigheid van TF-dragende exosomen is gemeld 30,33,34,35. We raden aan om EV's in plasma te pelleteren met 100.000 × g om de totale hoeveelheid EVTF-activiteit in het monster nauwkeuriger te bepalen. Merk op dat het een ultracentrifuge en een langere testtijd vereist omdat de centrifugatietijd toeneemt van 15 minuten tot 70 minuten.
Deze methode kan worden toegepast op plasmamonsters van elke soort ziekte. EVTF-activiteit wordt in verband gebracht met de ernst en overleving van de ziekte bij patiënten met verschillende ziekten, waaronder kanker, COVID-19, bacteriële infectie en cirrose 23,26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er zijn geen tegenstrijdige belangen om bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) en het John C. Parker professorship (N.M.). We willen mevrouw Sierra J. Archibald bedanken voor haar nuttige opmerkingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
| 1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
| 15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
| 21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
| 96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
| Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
| Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
| Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |
References
- Grover, S. P., Mackman, N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).
- Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H. The local phospholipid environment modulates the activation of blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6556-6563 (2007).
- Tavoosi, N., et al. Molecular determinants of phospholipid synergy in blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23247-23253 (2011).
- Wang, J., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. M. Sphingomyelin encrypts tissue factor: ATP-induced activation of A-SMase leads to tissue factor decryption and microvesicle shedding. Blood Advances. 1 (13), 849-862 (2017).
- Kornhuber, J., Rhein, C., Muller, C. P., Muhle, C. Secretory sphingomyelinase in health and disease. Biological Chemistry. 396 (6-7), 707-736 (2015).
- Versteeg, H. H., Ruf, W. Tissue factor coagulant function is enhanced by protein-disulfide isomerase independent of oxidoreductase activity. Journal of Biological Chemistry. 282 (35), 25416-25424 (2007).
- Reinhardt, C., et al. Protein disulfide isomerase acts as an injury response signal that enhances fibrin generation via tissue factor activation. Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 1110-1122 (2008).
- Langer, F., et al. Rapid activation of monocyte tissue factor by antithymocyte globulin is dependent on complement and protein disulfide isomerase. Blood. 121 (12), 2324-2335 (2013).
- Bogdanov, V. Y., et al. Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein. Nature Medicine. 9 (4), 458-462 (2003).
- Mackman, N. Alternatively spliced tissue factor - one cut too many. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 5-8 (2007).
- Censarek, P., Bobbe, A., Grandoch, M., Schror, K., Weber, A. A. Alternatively spliced human tissue factor (asHTF) is not pro-coagulant. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 11-14 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Osterud, B., Bjorklid, E. Tissue factor in blood cells and endothelial cells. Frontiers in Bioscience (Elite Edition). 4 (1), 289-299 (2012).
- Hisada, Y., Mackman, N. Cancer cell-derived tissue factor-positive extracellular vesicles: biomarkers of thrombosis and survival. Current Opinion in Hematology. 26 (5), 349-356 (2019).
- Vatsyayan, R., Kothari, H., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. 4-Hydroxy-2-nonenal enhances tissue factor activity in human monocytic cells via p38 mitogen-activated protein kinase activation-dependent phosphatidylserine exposure. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (7), 1601-1611 (2013).
- Mackman, N., Sachetto, A. T. A., Hisada, Y. Measurement of tissue factor-positive extracellular vesicles in plasma: strengths and weaknesses of current methods. Current Opinion in Hematology. 29 (5), 266-274 (2022).
- Lee, R. D., et al. Pre-analytical and analytical variables affecting the measurement of plasma-derived microparticle tissue factor activity. Thrombosis Research. 129 (1), 80-85 (2012).
- Claussen, C., et al. Microvesicle-associated tissue factor procoagulant activity for the preoperative diagnosis of ovarian cancer. Thrombosis Research. 141, 39-48 (2016).
- Mackman, N., Hisada, Y., Archibald, S. J., et al. Tissue factor and its procoagulant activity on cancer-associated thromboembolism in pancreatic cancer: Comment by Mackman et al. Cancer Science. 113 (5), 1885-1887 (2022).
- Sachetto, A. T. A., et al. Evaluation of four commercial ELISAs to measure tissue factor in human plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100133 (2023).
- Archibald, S. J., Hisada, Y., Bae-Jump, V. L., Mackman, N. Evaluation of a new bead-based assay to measure levels of human tissue factor antigen in extracellular vesicles in plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 6 (2), e12677 (2022).
- Tatsumi, K., et al. Evaluation of a new commercial assay to measure microparticle tissue factor activity in plasma: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (11), 1932-1934 (2014).
- Hisada, Y., et al. Measurement of microparticle tissue factor activity in clinical samples: A summary of two tissue factor-dependent FXa generation assays. Thrombosis Research. 139, 90-97 (2016).
- Tatsumi, K., Hisada, Y., Connolly, A. F., Buranda, T., Mackman, N. Patients with severe orthohantavirus cardiopulmonary syndrome due to Sin Nombre Virus infection have increased circulating extracellular vesicle tissue factor and an activated coagulation system. Thrombosis Research. 179, 31-33 (2019).
- Schmedes, C. M., et al. Circulating Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity During Orthohantavirus Infection Is Associated With Intravascular Coagulation. Journal of Infectious Diseases. 222 (8), 1392-1399 (2020).
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-Brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Campbell, R. A., et al. Comparison of the coagulopathies associated with COVID-19 and sepsis. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), e12525 (2021).
- Guervilly, C., et al. Dissemination of extreme levels of extracellular vesicles: tissue factor activity in patients with severe COVID-19. Blood Advances. 5 (3), 628-634 (2021).
- Hisada, Y., Mackman, N. Measurement of tissue factor activity in extracellular vesicles from human plasma samples. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3 (1), 44-48 (2019).
- Sachetto, A. T. A., et al. Tissue factor activity of small and large extracellular vesicles in different diseases. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100124 (2023).
- Bom, V. J., Bertina, R. M. The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII. Biochemical Journal. 265 (2), 327-336 (1990).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue factor activity is increased in a combined platelet and microparticle sample from cancer patients. Thrombosis Research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 47 (2021).
- Garnier, D., et al. Cancer cells induced to express mesenchymal phenotype release exosome-like extracellular vesicles carrying tissue factor. Journal of Biological Chemistry. 287 (52), 43565-43572 (2012).
- Park, J. A., et al. Tissue factor-bearing exosome secretion from human mechanically stimulated bronchial epithelial cells in vitro and in vivo. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (6), 1375-1383 (2012).
