Summary
Aquí describimos un ensayo interno de actividad del factor tisular de vesículas extracelulares. Se han utilizado ensayos basados en la actividad y ensayos basados en antígenos para medir el factor tisular en vesículas extracelulares a partir de muestras de plasma humano. Los ensayos basados en la actividad tienen una mayor sensibilidad y especificidad que los ensayos basados en antígenos.
Abstract
El factor tisular (TF) es un receptor transmembrana del factor (F) VII y FVIIa. El complejo TF/FVIIa inicia la cascada de la coagulación activando tanto FIX como FX. El TF se libera de las células a la circulación en forma de vesículas extracelulares (VE). El nivel de VE TF positivo (+) está aumentado en diversas enfermedades, como el cáncer, las infecciones bacterianas y virales y la cirrosis, y se asocia con trombosis, coagulación intravascular diseminada, gravedad de la enfermedad y mortalidad. Hay dos formas de medir los VE de TF+ en plasma: ensayos basados en antígenos y en actividades. Los datos indican que los ensayos basados en la actividad tienen una mayor sensibilidad y especificidad que los ensayos basados en antígenos. Este artículo describe nuestro ensayo interno de actividad EVTF basado en un ensayo de generación de FXa en dos etapas. FVIIa, FX y calcio se agregan a las muestras que contienen TF+ EV para generar FXa en presencia y ausencia de anticuerpos anti-TF para distinguir la generación de FXa dependiente de TF de la generación de FXa independiente de TF. Para determinar el nivel de FXa se utiliza un sustrato cromogénico escindido por FXa, mientras que para la determinación de la concentración de TF se utiliza una curva estándar generada con un TF recombinante relipidado. Este ensayo de actividad EVTF interno tiene una mayor sensibilidad y especificidad que un ensayo de actividad TF comercial.
Introduction
La coagulación sanguínea se inicia con la unión del factor (F) VII/VIIa al factor tisular (TF)1. El complejo TF/FVIIa activa tanto FIX como FX para activar la coagulación sanguínea1. Hay dos formas de TF de longitud completa unida a la membrana: encriptada y activa. Además, existe una forma alternativa de TF empalmada (asTF). La esfingomielina y la fosfatidilcolina en la valva externa de la membrana celular mantienen el TF en un estado encriptado 2,3,4. Cuando las células se activan o se dañan, la fosfolípido scramblasa transfiere fosfatidilserina y otros fosfolípidos cargados negativamente a la valvaexterna 1. La activación de las células también da lugar a la translocación de la esfingomielinasa ácida a la valva externa, donde degrada la esfingomielina a ceramida5. Estos dos mecanismos convierten TF encriptado en la forma activa. También se propone que la proteína disulfuro isomerasa media la formación de enlaces disulfuro entre Cys186 y Cys209 en TF cifrado, lo que resulta en el descifrado de TF 6,7,8. asTF también está presente en la circulación, pero carece del dominio transmembrana y, por lo tanto, es soluble 9,10. Es importante destacar que el TF tiene niveles muy bajos de actividad procoagulante en comparación con el TF activo de longitud completa10,11.
Las vesículas extracelulares (VE) se liberan de las células huésped en reposo, activadas y moribundas, así como de las células cancerosas12. Los VE expresan proteínas de sus células parentales12. Los VE activos portadores de TF se liberan de los monocitos activados, las células endoteliales y las células tumorales a la circulación 13,14,15. Los niveles de TF en plasma pueden medirse mediante ensayos basados en la actividad y en el antígeno. Los ensayos basados en antígenos incluyen ELISA y citometría de flujo16. Hay dos ensayos diferentes basados en la actividad: ensayos de actividad TF de una y dos etapas. El ensayo de una etapa se basa en un ensayo de coagulación basado en plasma. La muestra que contiene TF se añade al plasma y se mide el tiempo necesario para formar un coágulo después de la recalcificación. El ensayo de dos etapas mide la generación de muestras de FXa mediante la adición de FVII o FVIIa, FX y calcio. Los niveles de FXa se determinan utilizando un sustrato que es escindido por FXa.
Tanto en los ensayos de actividad de TF de una como de dos etapas, la concentración de TF se determina mediante una curva estándar generada con TF recombinante. Los ensayos de dos etapas tienen mayor sensibilidad y especificidad que los ensayos de una etapa. Muchos estudios han confirmado que los ensayos basados en la actividad tienen mayor sensibilidad y especificidad que los ensayos basados en antígenos 17,18,19,20,21. Además, nuestro ensayo de actividad interno tiene una mayor sensibilidad y especificidad que un ensayo de actividad comercial22. Los individuos sanos tienen niveles muy bajos o indetectables de actividad EVTF en plasma. Por el contrario, los individuos con condiciones patológicas, como cáncer, cirrosis, sepsis e infección viral, tienen niveles detectables de actividad EVTF y esto se asocia con trombosis, coagulación intravascular diseminada, gravedad de la enfermedad y mortalidad 23,24,25,26,27,28. Aquí, describiremos este ensayo interno de actividad EVTF de dos etapas.
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Protocol
La investigación fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill (número de protocolo: 14-2108).
1. Extracción de sangre de donantes
- Extraer sangre entera mediante venopunción limpia en la vena antecubital con una aguja de 21 G. Deseche los primeros 3 ml de sangre porque esta porción de sangre puede contener TF de células perivasculares.
- Extraiga 2,7 o 1,8 ml (dependiendo del tamaño de los tubos) de sangre en un vacutainer que contenga citrato de sodio al 3,2% (0,109 mol/L). No llene los tubos de más o de menos. Invierta suavemente los tubos inmediatamente después de la extracción de sangre para dispersar el citrato de sodio.
- Evite la agitación si los tubos se transportan antes del procesamiento. Prepare el plasma dentro de las 2 h posteriores a la extracción de sangre.
2. Preparación del plasma de control negativo
NOTA: Las muestras no deben colocarse en hielo en ningún momento antes de la congelación final.
- Prepare plasma de control negativo con sangre entera de voluntarios sanos. Inmediatamente después de la extracción de sangre, prepare plasma libre de plaquetas de la siguiente manera.
- Transfiera muestras de sangre de los tubos vacutainer a tubos de 15 ml.
- Centrifugar muestras de sangre a 2.500 × g durante 15 min a temperatura ambiente (20-24 °C) sin freno.
- Transfiera el sobrenadante (plasma pobre en plaquetas) a un nuevo tubo y repita el centrifugado en las mismas condiciones.
- Transfiera el sobrenadante (plasma con plaquetas) a un tubo nuevo.
- Alícuota de la muestra en alícuotas de ≥100 μL. Deje aproximadamente 100 μL en el fondo del tubo.
- Congelar inmediatamente el plasma sin plaquetas a -80 °C (Figura 1).
3. Preparación del plasma de control positivo
NOTA: La respuesta al lipopolisacárido es variable entre individuos.
- Transfiera muestras de sangre de los vacutainers a tubos de 15 ml.
- Preparar plasma de control positivo utilizando sangre entera de voluntarios sanos estimulados con lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli O111:B4 (10 μg/mL) durante 5 h a 37 °C con agitación.
- Después de 5 h de incubación, siga los pasos 2.1.2 a 2.1.6.
4. Aislamiento de vesículas extracelulares del plasma
NOTA: Es posible que los gránulos EV no sean visibles. El tiempo de descongelación depende del volumen de la muestra, pero normalmente descongelamos 100 μL de plasma durante 30 minutos a 37 °C.
- Descongelar las muestras de plasma a 37 °C.
- Añadir 1 mL de HBSA sin tampón de calcio [HBSA-Ca(-)] [137 mM de NaCl, 5,38 mM de KCl, 5,55 mM de glucosa, 10 mM de HEPES, 0,1% (p/v) de albúmina sérica bovina] a cada 100 μL de muestra de plasma en un tubo de 1,5 mL.
- Centrifugar muestras de plasma a 20.000 × g durante 15 min a 4 °C.
- Aspire el sobrenadante hasta 20 μL sin alterar el gránulo EV.
- Reconstituya el gránulo de EV añadiendo 1 ml de tampón HBSA-Ca(-) a cada tubo, pipetee hacia arriba y hacia abajo en la ubicación del gránulo de EV y vórtice cada tubo antes de centrifugar por segunda vez a 20.000 × g durante 15 min a 4 °C.
- Aspire el sobrenadante hasta 20 μL sin alterar el gránulo EV.
- Reconstituya el gránulo de EV en 80 μL de HBSA-Ca(-) y pipetee hacia arriba y hacia abajo en la ubicación del gránulo de EV (Figura 2).
5. Opción: Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares mediante ultracentrífuga
- Después del paso 4.3, recoja el sobrenadante y la ultracentrífuga a 100.000 × g durante 70 min a 4 °C.
- Aspire el sobrenadante hasta 20 μL sin alterar el gránulo EV.
- Reconstituya el gránulo EV añadiendo 1 ml de tampón HBSA-Ca(-) a cada tubo y vórtice cada tubo antes de ultracentrifugar por segunda vez a 100.000 × g durante 70 min a 4 °C.
- Aspire el sobrenadante hasta 20 μL sin alterar el gránulo EV.
- Reconstituir el gránulo de EV en 80 μL de HBSA-Ca(-).
6. Medición de la actividad del factor tisular de la vesícula extracelular
NOTA: Las muestras de EV deben pipetearse y agitarse en vórtice para mezclarlas antes de agregarlas a los pocillos. El EDTA-disódico inhibirá la capacidad del FXa para escindir el sustrato cromogénico. Por lo tanto, el EDTA-disódico no puede utilizarse como sustituto del EDTA-tetrasódico en el paso 6.7.
- Agregue 40 μL de una muestra de EV a dos pocillos de una placa de 96 pocillos.
- Añadir 11 μL de una IgG inhibidora de TF anti-humano de ratón [(36,4 μg/mL, concentración final de 7,8 μg/mL)] a un pocillo de una muestra de EV y 11 μL de IgG de ratón control [(36,4 μg/mL, concentración final de 7,8 μg/mL)] al otro pocillo.
- Incube la placa de 96 pocillos durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Durante el tiempo de incubación, prepare 50 μL/pocillo de patrones de TF (0, 0,32, 0,63, 1,25, 2,5, 5, 10 y 20 pg/mL) por duplicado utilizando TF recombinante relipidado.
- Prepare la mezcla de factores mezclando 4 mL de HBSA con calcio [HBSA-Ca(+)] [HBSA-Ca(-) + 10 mM CaCl2, concentración final 10 mM], 800 μL de 900 nM FX en HBSA-Ca(+) (concentración final: 146,4 nM) y 120 μL de 200 nM FVIIa en HBSA-CA(+) (concentración final: 4,8 nM).
- Añadir 50 μL de la solución de mezcla de factores a cada pocillo, cubrir la placa con film e incubar durante 2 h en una incubadora a 37 °C.
- Después de 2 h, detener la generación de FXa añadiendo 25 μL de tampón de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) HBSA [HBSA-Ca(-) + 25 mM EDTA-tetrasodio, concentración final 5 mM] e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- Reconstituir el sustrato cromogénico que se escinde por FXa a 4 mM (añadir 8,7 mL de agua destilada a un vial de 25 mg).
- Añadir 25 μL de la solución de sustrato cromogénico a cada pocillo, cubrir la placa con film y luego con papel de aluminio para protegerla de la luz, e incubar durante 15 min a 37 °C.
- Después de 15 min de incubación, retire las burbujas con una aguja o por centrifugación a 1.500 × g durante 1 min.
- Lea la placa a 405 nm usando un lector de placas con una mezcla antes de leer.
- Convierta la generación de FXa de cada pozo en actividad TF utilizando la curva estándar generada utilizando TF recombinante relipidado.
- Calcule la generación de FXa dependiente de TF (actividad EVTF) utilizando la ecuación (1):
Generación de FXa dependiente de TF (actividad de EVTF [pg/mL]) = Generación total de FXa (pocillo de IgG de control) - Generación de FXa independiente de TF (pocillo de IgG anti-TF) (Figura 3) (1)
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Representative Results
Un resultado exitoso da un valor de control positivo de ≥0,5 pg/mL y un valor de control negativo de <0,5 pg/mL. Lo mejor es encontrar un respondedor de LPS alto con una actividad EVTF de >1,0 pg/ml para un control positivo. El resultado representativo muestra la actividad EVTF de las VE aisladas del plasma de la sangre total de 11 donantes sanos, con y sin activación de LPS (Figura 4). Seis de los once donantes (donantes 2, 4, 5, 8, 10, 11) respondieron de media a alta LPS, mientras que cinco de los once donantes (donantes 1, 3, 6, 7, 9) respondieron a una LPS baja.
Figura 1: Preparación de plasma deplecionado de plaquetas. La cifra fue modificada a partir de Hisada y Mackman29. Abreviatura: PDP = plasma con depleción de plaquetas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Aislamiento de vesículas extracelulares a partir de plasma con depleción plaquetaria. La cifra fue modificada a partir de Hisada y Mackman29. Abreviaturas: PDP = plasma deplecionado de plaquetas; EVs = vesículas extracelulares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Medición de la actividad del factor tisular de la vesícula extracelular. La cifra fue modificada a partir de Hisada y Mackman29. Abreviaturas: TF = factor tisular; EVs = vesículas extracelulares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Actividad EVTF del plasma de sangre total de 11 donantes sanos, con y sin activación de LPS. La activación de LPS se realizó en las mismas condiciones que el control positivo. El control positivo procedía de un respondedor conocido de LPS, mientras que en el momento del experimento no se conocían las respuestas a LPS de 11 donantes sanos. Las barras blancas y negras indican con y sin activación LPS, respectivamente. Abreviaturas: EVTF = factor tisular de vesícula extracelular; LPS = lipopolisacárido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Resumen de los estudios que comparan este ensayo de actividad de EVTF interno, un ELISA de TF comercial y un ensayo de actividad. Abreviaturas: EVTF = factor tisular de vesícula extracelular; ELISA = ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Aquí, se presenta el protocolo de nuestro ensayo de actividad EVTF interno. Hay tres pasos críticos en el protocolo. Al reconstituir el gránulo EV, es importante pipetear hacia arriba y hacia abajo en la ubicación del gránulo EV, incluso si no es visible. La reconstitución incompleta del gránulo de EV dará lugar a un falso negativo o a una subestimación de los valores de actividad de EVTF de las muestras. En segundo lugar, el uso de HBSA-Ca(+) es fundamental en el paso 6.5 del protocolo porque la generación de FXa no se puede generar sin calcio. En tercer lugar, el uso de EDTA-tetrasódico pero no EDTA-disódico para detener la generación de FXa es fundamental porque este último inhibe la capacidad de FXa para escindir el sustrato cromogénico.
Recomendamos el siguiente método de almacenamiento y uso para cada reactivo. Almacenamos los tampones de ensayo y el sustrato reconstituido a 4 °C y los usamos repetidamente hasta que se nos acaban. Si no nos quedamos sin sustrato en 2-3 semanas, lo desechamos porque se vuelve amarillo. Almacenamos TF recombinante, anticuerpos, FVIIa y FX a -80 °C y recomendamos hacer alícuotas para un ensayo para evitar un ciclo de congelación-descongelación.
En un estudio preliminar, dejamos muestras de plasma durante 9 h a temperatura ambiente, las volvimos a congelar a -80 °C durante la noche y realizamos el ensayo al día siguiente. Como control, descongelamos el mismo plasma y lo volvimos a congelar inmediatamente. Encontramos que la muestra dejada durante 9 h a temperatura ambiente tuvo una disminución del 16% en la actividad de EVTF en comparación con la que se descongeló y se volvió a congelar inmediatamente (Hisada y Mackman, datos no publicados 2017).
Además de la diferencia en la respuesta a LPS, la diferencia en la concentración de VE en plasma de donantes individuales puede explicar la diferente actividad de EVTF de diferentes donantes. De hecho, observamos algunas variaciones en las concentraciones de EV en plasma de sangre total estimulada con LPS (1,9 ± 0,6 ×10 10 partículas/mL, n = 6, media ± desviación estándar)30.
Este ensayo de actividad EVTF interno tiene varias características que los ensayos comerciales no tienen. En primer lugar, el ensayo utiliza un anticuerpo anti-TF para distinguir la generación de FXa dependiente de TF de la generación de FXa independiente de TF. Se afirma que tres ensayos de actividad comercial miden la actividad del TF en plasma, pero ninguno de ellos utiliza anticuerpos anti-TF16. Por lo tanto, estos ensayos comerciales simplemente miden la generación total de FXa, pero no la generación de FXa dependiente de TF. En segundo lugar, utilizamos 2,4 nM de FVIIa (la concentración final en la reacción) para minimizar la generación de FXa independiente de TF por FVIIa. Un ensayo de actividad comercial utiliza 12 nM de FVIIa en la reacción, lo que da un alto fondo22. De hecho, el FVIIa activa el FX linealmente dependiendo de la concentración de FVIIa en ausencia de TF31. En la Tabla 1 se resumieron los estudios que compararon este ensayo de actividad de EVTF interno y el ELISA de TF comercial y un ensayo de actividad.
Se proponen cuatro clasificaciones de respuesta de la actividad de EVTF para plasma pobre en plaquetas citratos: cero (0 a <0,5 pg/mL); débil (0,5 a <1,0 pg/mL), moderada (1,0 a <2,0 pg/mL) y fuerte (≥2,0 pg/mL)23. En particular, los diferentes anticoagulantes afectan los resultados de los ensayos de actividad de EVTF. Por ejemplo, se observaron niveles más altos de actividad de EVTF usando heparina después de la estimulación con LPS en comparación con citrato de sodio (Donante A: 4,6 (citrato) frente a 28,6 (heparina) pg/ml y Donante B: 3,4 (citrato) frente a 26,0 (heparina) pg/mL, respectivamente, datos no publicados de Hisada y Mackman 2017). Por el contrario, se observaron niveles más bajos de actividad de EVTF utilizando EDTA después de la estimulación con LPS en comparación con el citrato de sodio (Donante C: 3,9 (citrato) frente a 1,4 (EDTA) pg/mL, Donante D: 3,8 (citrato) frente a 0,4 (EDTA) pg/mL, respectivamente, Tatsumi y Mackman datos no publicados 2016). Estos resultados indican que los datos de actividad de EVTF no son comparables cuando se utilizan diferentes anticoagulantes.
El método tiene algunas limitaciones. El coeficiente de variación (CV) es relativamente alto en comparación con los ensayos clínicos. De hecho, el CV para el control positivo en siete estudios independientes fue del 24%17,29. Aislamiento de vehículos eléctricos mediante gránulos de centrifugación, no solo vehículos eléctricos, sino también residuos celulares. Previamente analizamos el pellet de plasma rico en plaquetas mediante microscopía electrónica de transmisión y observamos plaquetas, EVs y restos celulares32. Utilizamos un rotor de ángulo fijo y no hemos experimentado un rotor basculante para una centrifugación de 20.000 × g. Recientemente descubrimos que los vehículos eléctricos pequeños que se pueden peletizar con 100.000 × g pero no con 20.000 × g tienen actividad EVTF en pacientes con cáncer de páncreas y COVID-1930. Esto indica que este protocolo no mide la actividad de EVTF de pequeños VE, como los exosomas. Cabe destacar que los exosomas son VE ricos en esfingomielina y se ha reportado la presencia de exosomas portadores de TF 30,33,34,35. Recomendamos la granulación de EV en plasma utilizando 100.000 × g para determinar con mayor precisión la cantidad total de actividad de EVTF en la muestra. Cabe destacar que requiere una ultracentrífuga y un tiempo de ensayo más largo porque el tiempo de centrifugación aumenta de 15 min a 70 min.
Este método se puede aplicar a muestras de plasma de cualquier tipo de enfermedad. La actividad de EVTF se asocia con la gravedad de la enfermedad y la supervivencia en pacientes con diferentes enfermedades, incluyendo cáncer, COVID-19, infección bacteriana y cirrosis 23,26,27.
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Disclosures
No hay intereses contrapuestos que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH NHLBI R35HL155657 (Nuevo México) y la cátedra John C. Parker (Nuevo México). Nos gustaría agradecer a la Sra. Sierra J. Archibald por sus útiles comentarios
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
| 1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
| 15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
| 21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
| 96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
| Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
| Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
| Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |
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