Summary
ここでは、社内の細胞外小胞組織因子活性アッセイについて説明します。活性ベースのアッセイおよび抗原ベースのアッセイは、ヒト血漿サンプルからの細胞外小胞中の組織因子を測定するために使用されています。活性ベースのアッセイは、抗原ベースのアッセイよりも高い感度と特異性を持っています。
Abstract
組織因子(TF)は、第VII因子およびFVIIaの膜貫通型受容体です。TF/FVIIa複合体は、FIXとFXの両方を活性化することにより、凝固カスケードを開始します。TFは細胞外小胞(EV)の形で細胞から循環中に放出されます。TF陽性(+)EVのレベルは、がん、細菌およびウイルス感染、肝硬変などのさまざまな疾患で増加し、血栓症、播種性血管内凝固、疾患の重症度、および死亡率に関連しています。血漿中のTF+ EVを測定するには、抗原アッセイと活性ベースアッセイの2つの方法があります。活性ベースのアッセイは、抗原ベースのアッセイよりも感度と特異性が高いことがデータで示されています。本稿では、2段階のFXa生成アッセイに基づく当社独自のEVTF活性アッセイについて述べる。TF+ EV含有サンプルにFVIIa、FX、およびカルシウムを添加して、抗TF抗体の存在下および非存在下でFXaを生成し、TF依存性FXa生成とTF非依存性FXa生成を区別します。FXaで切断された発色基質を使用してFXaレベルを決定し、再置換組換えTFで生成された標準曲線を使用してTF濃度を決定します。この社内EVTF活性アッセイは、市販のTF活性アッセイよりも高い感度と特異性を備えています。
Introduction
血液凝固は、第VII/VIIa因子(F)が組織因子(TF)1に結合することで開始されます。TF/FVIIa複合体は、FIXとFXの両方を活性化し、血液凝固を活性化します1。完全長の膜結合型TFには、暗号化とアクティブの2つの形式があります。さらに、選択的スプライス形式のTF(asTF)があります。細胞膜の外側のリーフレットにあるスフィンゴミエリンとホスファチジルコリンは、TFを暗号化された状態に維持します2,3,4。細胞が活性化または損傷されると、リン脂質スクランブラーゼはホスファチジルセリンおよび他の負に帯電したリン脂質を外尖1に転移させる。細胞の活性化はまた、酸性スフィンゴミエリナーゼの外側のリーフレットへの転座をもたらし、そこでスフィンゴミエリンをセラミド5に分解します。これら 2 つのメカニズムは、暗号化された TF をアクティブな形式に変換します。また、プロテインジスルフィドイソメラーゼは、暗号化されたTF中のCys186とCys209の間のジスルフィド結合形成を媒介し、TF 6,7,8の解読をもたらすことも提案されています。asTFも循環中に存在しますが、膜貫通ドメインを欠いているため、可溶性です9,10。重要なことに、asTFは、全長の活性TF10,11と比較して、非常に低いレベルの凝固促進活性を有する。
細胞外小胞(EV)は、休止中、活性化中、および死にかけている宿主細胞、および癌細胞から放出されます12。EVは親細胞からタンパク質を発現する12.活性TF担持EVは、活性化された単球、内皮細胞、および腫瘍細胞から循環中に放出される13,14,15。血漿中のTFレベルは、活性および抗原ベースのアッセイによって測定できます。抗原ベースのアッセイには、ELISAとフローサイトメトリーが含まれます16。活性ベースのアッセイには、1段階と2段階のTF活性アッセイの2種類があります。1段階アッセイは、血漿ベースの凝固アッセイに基づいています。TF含有サンプルを血漿に添加し、再石灰化後に血栓を形成する時間を測定します。2段階アッセイは、FVIIまたはFVIIa、FX、およびカルシウムを添加することにより、サンプルのFXa生成を測定します。FXaレベルは、FXaによって切断された基質を使用して決定されます。
1段階および2段階のTF活性アッセイでは、組換えTFで生成された検量線を使用してTF濃度が決定されます。2段階アッセイは、1段階アッセイよりも感度と特異性が高くなります。多くの研究により、活性ベースのアッセイは抗原ベースのアッセイよりも高い感度と特異性があることが確認されています17、18、19、20、21。さらに、当社の社内活性アッセイは、商業活性アッセイよりも高い感度と特異性を持っています22。健康な人は、血漿中のEVTF活性のレベルが非常に低いか、検出できません。対照的に、癌、肝硬変、敗血症、ウイルス感染などの病理学的状態の個人は、検出可能なレベルのEVTF活性を持ち、これは血栓症、播種性血管内凝固、疾患の重症度、および死亡率に関連しています23,24,25,26,27,28。ここでは、この社内の2段階のEVTF活性アッセイについて説明します。
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Protocol
この研究は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校の治験審査委員会(プロトコル番号:14-2108)によって承認されました。
1. ドナーからの採血
- 21Gの針で肘前静脈にきれいな静脈穿刺を使用して全血を採取します。血液の最初の3 mLは、血管周囲細胞からのTFが含まれている可能性があるため、廃棄してください。.
- 2.7 mLまたは1.8 mL(チューブのサイズに応じて)の血液を、3.2%クエン酸ナトリウム(0.109 mol/L)を含むバキュテナーに吸い込みます。チューブを過充填または過少充填しないでください。採血直後にチューブを静かに反転させ、クエン酸ナトリウムを分散させます。
- 処理前にチューブを輸送する場合は、攪拌を避けてください。採血から2時間以内に血漿を調製します。
2. ネガティブコントロールプラズマの調製
注意: サンプルは、最終凍結前に氷上に置いないでください。
- 健康なボランティアの全血を使用してネガティブコントロール血漿を準備します。採血後すぐに、以下のように無血小板血漿を調製します。
- 血液サンプルをバキュテナーチューブから15 mLチューブに移します。
- 2,500 × g の血液サンプルを室温(20〜24°C)で15分間、ブレーキなしで遠心分離します。
- 上清(血小板不足血漿)を新しいチューブに移し、同じ条件でスピンを繰り返します。
- 上清(血小板枯渇血漿)を新しいチューブに移します。
- サンプルを≥100 μLのアリコートに分注します。チューブの底に約100μLを残します。
- 血小板が枯渇した血漿を直ちに-80°Cで凍結します(図1)。
3. ポジティブコントロールプラズマの調製
注:リポ多糖に対する反応は個人差があります。
- 血液サンプルをバキュテナーから15 mLチューブに移します。
- 大腸菌 O111:B4 (10 μg/mL) 由来のリポ多糖類 (LPS) で刺激した健康なボランティアの全血を用いて、37 °C で 5 時間、攪拌しながらポジティブコントロール血漿を調製します。
- 5時間のインキュベーション後、ステップ2.1.2〜2.1.6に従います。
4. 血漿からの細胞外小胞の単離
注意: EVペレットは見えない場合があります。解凍時間はサンプル量によって異なりますが、通常、100μLのプラズマを37°Cで30分間解凍します。
- 血漿サンプルを37°Cで解凍します。
- 1.5 mLチューブ内の血漿サンプル100 μLそれぞれに、カルシウムを含まないHBSA [HBSA-Ca(-)]バッファー[137 mM NaCl、5.38 mM KCl、5.55 mMグルコース、10 mM HEPES、0.1%(w/v)ウシ血清アルブミン]を1 mL添加します。
- 血漿サンプルを20,000 × g で4°Cで15分間遠心分離します。
- 上清を20μLまで吸引し、EVペレットを乱すことなく吸引します。
- 各チューブに1 mLのHBSA-Ca(-)バッファーを添加してEVペレットを再溶解し、EVペレットの位置でピペットを上下させ、各チューブをボルテックスしてから、20,000 × g で4°Cで15分間2回目の遠心分離を行います。
- 上清を20μLまで吸引し、EVペレットを乱すことなく吸引します。
- EVペレットを80 μLのHBSA-Ca(-)で再溶解し、EVペレットの位置でピペットで上下させます(図2)。
5. 選択:超遠心分離機による小さな細胞外小胞の単離
- ステップ4.3の後、上清を回収し、100,000 × g で4°Cで70分間超遠心分離します。
- 上清を20μLまで吸引し、EVペレットを乱すことなく吸引します。
- 1 mLのHBSA-Ca(-)緩衝液を各チューブに添加してEVペレットを再溶解し、各チューブをボルテックスしてから、100,000 × g で4°Cで70分間2回目の超遠心分離を行います。
- 上清を20μLまで吸引し、EVペレットを乱すことなく吸引します。
- EVペレットを80 μLのHBSA-Ca(-)で再溶解します。
6. 細胞外小胞組織因子活性の測定
注:EVサンプルは、ウェルに添加する前に、ピペッティングしてボルテックスウェルにボルテックスし、混合する必要があります。EDTA-二ナトリウムは、FXaが発色基質を切断する能力を阻害します。したがって、EDTA-二ナトリウムは、ステップ6.7のEDTA-四ナトリウムの代替品として使用することはできません。
- 40 μL の EV サンプルを 96 ウェルプレートの 2 つのウェルに添加します。
- 11 μL の抑制性マウス抗ヒト TF IgG [(36.4 μg/mL、最終濃度 7.8 μg/mL)] を 1 つの EV サンプルのウェルに、11 μL のコントロールマウス IgG [(36.4 μg/mL、最終濃度 7.8 μg/mL)] をもう 1 つのウェルに加えます。
- 96ウェルプレートを室温で15分間インキュベートします。
- インキュベーション時間中に、50 μL/ウェルのTF標準試料(0、0.32、0.63、1.25、2.5、5、10、20 pg/mL)を、再結合した組換えTFを使用して2回調製します。
- 4 mL の HBSA とカルシウム [HBSA-Ca(+)] [HBSA-Ca(-) + 10 mM CaCl2、最終濃度 10 mM]、800 μL の 900 nM FX HBSA-Ca(+) (最終濃度: 146.4 nM)、および 120 μL の 200 nM FVIIa を HBSA-CA(+) (最終濃度: 4.8 nM) に混合して、因子ミックスを調製します。
- 因子混合溶液50 μLを各ウェルに加え、プレートをフィルムで覆い、37°Cのインキュベーターで2時間インキュベートします。
- 2時間後、25 μLのHBSAエチレンジアミン四酢酸(EDTA)バッファー[HBSA-Ca(-)+ 25 mM EDTA-四ナトリウム、最終濃度5 mM]を添加してFXaの生成を停止し、室温で5分間インキュベートします。
- FXaで4 mMに切断された発色基質を再構成します(25 mgバイアルに8.7 mLの蒸留水を加えます)。
- 発色基質溶液25 μLを各ウェルに加え、プレートをフィルムで覆い、次にアルミホイルで覆って光から保護し、37°Cで15分間インキュベートします。
- 15分間のインキュベーション後、ニードルまたは1,500 × g で1分間遠心分離することにより、気泡を除去します。
- 読み取り前に、1つのミックスでプレートリーダーを使用してプレートを405 nmで読み取ります。
- 再置換された組換えTFを使用して生成された検量線を使用して、各ウェルのFXa生成をTF活性に変換します。
- 式 (1) を使用して、TF 依存性の FXa 生成 (EVTF アクティビティ) を計算します。
TF依存性FXa生成(EVTF活性[pg/mL]) = 総FXa生成量(コントロールIgGウェル) - TF非依存性FXa生成(抗TF IgGウェル)(図3)(1)
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Representative Results
良好な結果を得ると、≥0.5 pg/mL の陽性対照値と <0.5 pg/mL の陰性制御値が得られます。ポジティブコントロールには、EVTF活性が>1.0 pg/mLの高LPSレスポンダーを見つけるのが最善です。代表的な結果は、LPS活性化の有無にかかわらず、11人の健康なドナーの全血から血漿から分離されたEVのEVTF活性を示しています(図4)。11人のドナーのうち6人(ドナー2、4、5、8、10、11)は中程度から高いLPSレスポンダーであり、11人のドナーのうち5人(ドナー1、3、6、7、9)は低LPSレスポンダーであった。
図1:血小板枯渇血漿の調製。 この図は、ヒサダとマックマン29から変更されました。略語:PDP =血小板枯渇血漿。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:血小板枯渇血漿からの細胞外小胞の単離。 この図は、ヒサダとマックマン29から変更されました。略語:PDP =血小板枯渇血漿;EV = 細胞外小胞。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:細胞外小胞組織因子活性の測定。 この図は、ヒサダとマックマン29から変更されました。略語:TF =組織因子;EV = 細胞外小胞。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:LPS活性化の有無にかかわらず、11人の健康なドナーの全血からの血漿のEVTF活性。 LPS活性化は、ポジティブコントロールと同じ条件で行いました。ポジティブコントロールは既知のLPSレスポンダーからのものであったが、11人の健康なドナーのLPSに対する反応は実験の時点では不明であった。白と黒のバーは、それぞれLPSアクティベーションの有無を示します。略語:EVTF =細胞外小胞組織因子;LPS = リポ多糖類。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
表1:この社内EVTF活性アッセイ、市販のTF ELISA、および活性アッセイを比較した研究の要約。 略語:EVTF =細胞外小胞組織因子;ELISA = 酵素結合免疫吸着アッセイ。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、当社社内EVTF活性アッセイのプロトコルを示します。このプロトコルには3つの重要なステップがあります。EVペレットを再構成する場合、EVペレットが見えない場合でも、EVペレットの位置でピペットを上下に動かすことが重要です。EVペレットの再構成が不完全な場合、サンプルのEVTF活性値の偽陰性または過小評価が発生します。第二に、カルシウムなしではFXa生成を生成できないため、プロトコルステップ6.5ではHBSA-Ca(+)の使用が重要です。第三に、EDTA-二ナトリウムではなくEDTA-四ナトリウムを使用してFXaの生成を止めることは、後者がFXaが発色基質を切断する能力を阻害するため、非常に重要です。
各試薬について、以下の保管方法と使用方法を推奨いたします。アッセイバッファーと再構成した基質を4°Cで保存し、使い果たせるまで繰り返し使用します。2〜3週間以内に基材がなくなると、黄色くなるので廃棄します。組換えTF、抗体、FVIIa、FXを-80°Cで保存し、凍結融解サイクルを避けるために、1回のアッセイでアリコートを作成することをお勧めします。
予備研究では、血漿サンプルを室温で9時間放置し、-80°Cで一晩再凍結し、翌日アッセイを実施しました。対照として、同じ血漿を解凍し、すぐに再凍結しました。室温で9時間放置したサンプルは、解凍してすぐに再凍結したサンプルと比較して、EVTF活性が16%低下することがわかりました(Hisada and Mackman、未発表データ2017)。
LPSに対する反応の違いに加えて、個々のドナーからの血漿中のEV濃度の違いは、異なるドナーの異なるEVTF活性を説明する可能性があります。実際、LPS刺激全血からの血漿中のEV濃度にいくつかの変動が観察されました(1.9 ± 0.6 ×10 10 粒子/mL、n = 6、平均±標準偏差)30。
この社内EVTF活性アッセイには、市販のアッセイにはないいくつかの特徴があります。まず、このアッセイでは、抗TF抗体を使用して、TF依存性FXa生成とTF非依存性FXa生成を区別します。血漿中のTF活性を測定するために3つの商業的活性アッセイが主張されているが、それらのどれも抗TF抗体を使用していない16。したがって、これらの市販アッセイは、単に総FXa生成を測定し、TF依存性FXa生成を測定しません。次に、2.4 nMのFVIIa(反応の最終濃度)を使用して、FVIIaによるTF非依存性FXa生成を最小限に抑えます。1つの商業活性アッセイは、反応に12 nMのFVIIaを使用し、これは高いバックグラウンドを与える22。実際、FVIIaは、TF31の非存在下でFVIIa濃度に依存してFXを線形に活性化する。この社内EVTF活性アッセイと市販のTF ELISAおよび活性アッセイを比較した研究を 表1にまとめました。
クエン酸血小板に乏しい血漿に対するEVTF活性の4つの応答分類が提案されています:ゼロ(0〜<0.5 pg / mL);弱い(0.5〜<1.0 pg/mL)、中等度(1.0〜<2.0 pg/mL)、強い(≥2.0 pg/mL)23。特に、さまざまな抗凝固剤がEVTF活性アッセイの結果に影響を与えます。例えば、LPS刺激後のヘパリンでは、クエン酸ナトリウムと比較して、より高いレベルのEVTF活性が観察されました(ドナーA:4.6(クエン酸)対28.6(ヘパリン)pg/mLおよびドナーB:それぞれ3.4(クエン酸)vs 26.0(ヘパリン)pg/mL、HisadaおよびMackman未発表データ2017)。対照的に、LPS刺激後のEDTAでは、クエン酸ナトリウムと比較してEVTF活性が低いことが観察されました(ドナーC:3.9(クエン酸)vs1.4(EDTA)pg/mL、ドナーD:それぞれ3.8(クエン酸)vs0.4(EDTA)pg/mL、TatsumiおよびMackman未発表データ2016)。これらの結果は、異なる抗凝固剤を使用した場合、EVTF活性データは比較できないことを示しています。
この方法にはいくつかの制限があります。変動係数(CV)は、臨床アッセイと比較して比較的高いです。実際、7つの独立した研究におけるポジティブコントロールのCVは24%でした17,29。遠心分離ペレットによるEVの分離 EVだけでなく、細胞の破片も。我々は以前、多血小板血漿のペレットを透過型電子顕微鏡で分析し、血小板、EV、細胞破片を観察した32。固定角ローターを使用しており、20,000 × gの遠心分離用のスイングアウトローターは経験していません。最近、100,000 × gでペレット化できるが、20,000 × gではペレット化できない小型EVが、膵臓がんとCOVID-19の患者でEVTF活性を示すことを発見しました30。これは、このプロトコルがエクソソームなどの小型EVからのEVTF活性を測定しないことを示しています。特に、エクソソームはスフィンゴミエリンに富むEVであり、TFを含むエクソソームの存在が報告されています30,33,34,35。サンプル中のEVTF活性の総量をより正確に測定するために、100,000 × gを使用してプラズマ中でEVをペレット化することをお勧めします。注目すべきは、遠心分離時間が15分から70分に増加するため、超遠心分離機とより長いアッセイ時間を必要とすることです。
この方法は、あらゆる種類の疾患の血漿サンプルに適用できます。EVTF活性は、がん、COVID-19、細菌感染、肝硬変など、さまざまな疾患の患者の疾患の重症度と生存率に関連しています23,26,27。
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Disclosures
開示すべき競合する利害関係はありません。
Acknowledgments
この研究は、NIH NHLBI R35HL155657(N.M.)とJohn C. Parker教授(N.M.)の支援を受けました。Sierra J. Archibald氏の有益なコメントに感謝します
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
| 1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
| 15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
| 21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
| 96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
| Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
| Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
| Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |
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