Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

בדיקת פעילות גורם רקמת שלפוחית חוץ-תאית

Published: December 29, 2023 doi: 10.3791/65840
Automatic Translation
1, 1
1Division of Hematology, UNC Blood Research Center, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

כאן אנו מתארים בדיקת פעילות רקמת שלפוחית חוץ-תאית בבית. בדיקות מבוססות פעילות ובדיקות מבוססות אנטיגן שימשו למדידת גורם רקמה בשלפוחיות חוץ-תאיות מדגימות פלזמה אנושיות. לבדיקות מבוססות פעילות יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר בדיקות מבוססות אנטיגן.

Abstract

גורם רקמה (TF) הוא קולטן טרנסממברנה עבור פקטור (F) VII ו- FVIIa. קומפלקס TF/FVIIa יוזם את מפל הקרישה על ידי הפעלת FIX ו- FX. TF משתחרר מתאים למחזור הדם בצורה של שלפוחיות חוץ-תאיות (EV). רמת ה-TF החיובי (+) לרכב חשמלי עולה במחלות שונות, כולל סרטן, זיהומים חיידקיים ונגיפיים ושחמת הכבד, וקשורה לפקקת, קרישה תוך-וסקולרית מפושטת, חומרת מחלות ותמותה. ישנן שתי דרכים למדוד TF+ EV בפלזמה: בדיקות מבוססות אנטיגן ופעילות. הנתונים מצביעים על כך שלבדיקות מבוססות פעילות יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר בדיקות מבוססות אנטיגן. מאמר זה מתאר את בדיקת פעילות ה- EVTF הפנימית שלנו המבוססת על בדיקת דור FXa דו-שלבית. FVIIa, FX וסידן מתווספים לדגימות המכילות TF+ EV כדי ליצור FXa בנוכחות ובהיעדר נוגדן נגד TF כדי להבדיל בין דור FXa תלוי TF לבין דור FXa שאינו תלוי ב- TF. מצע כרומוגני שנבקע על ידי FXa משמש לקביעת רמת FXa, בעוד שעקומה סטנדרטית הנוצרת עם TF רקומביננטי משומן משמשת לקביעת ריכוז TF. לבדיקת פעילות EVTF פנימית זו יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר בדיקת פעילות TF מסחרית.

Introduction

קרישת הדם מתחילה עם קשירה של גורם (F) VII/VIIa לגורם רקמה (TF)1. קומפלקס TF/FVIIa מפעיל הן את FIX והן את FX כדי להפעיל קרישת דם1. ישנן שתי צורות של TF באורך מלא, קשור לקרום: מוצפן ופעיל. בנוסף, קיימת צורה חלופית של TF (asTF). ספינגומיילין ופוספטידילכולין בעלון החיצוני של קרום התא שומרים על TF במצב מוצפן 2,3,4. כאשר תאים מופעלים או ניזוקים, סקרמבלאז פוספוליפידים מעביר פוספטידיל-סרין ופוספוליפידים אחרים בעלי מטען שלילי לעלון החיצוני1. הפעלת התאים גורמת גם לטרנסלוקציה של חומצה sphingomyelinase לעלון החיצוני, שם הוא מפרק sphingomyelin ל ceramide5. שני מנגנונים אלה ממירים TF מוצפן לצורה הפעילה. כמו כן מוצע כי חלבון דיסולפיד איזומראז מתווך היווצרות קשר דיסולפיד בין Cys186 ו- Cys209 ב- TF מוצפן, מה שמביא לביטול הצפנה של TF 6,7,8. asTF קיים גם במחזור הדם אך חסר את תחום הטרנסממברנה ולכן הוא מסיס 9,10. חשוב לציין, ל- asTF יש רמות נמוכות מאוד של פעילות מעודדת קרישה בהשוואה ל- TF פעילבאורך מלא 10,11.

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) משתחררות מתאים מארחים נחים, מופעלים וגוססים, כמו גם מתאי סרטן12. כלי רכב חשמליים מבטאים חלבונים מתאי הוריהם12. EV פעילים נושאי TF משוחררים ממונוציטים פעילים, תאי אנדותל ותאי גידול למחזור הדם 13,14,15. רמות TF בפלזמה ניתנות למדידה על ידי בדיקות מבוססות פעילות ואנטיגן. בדיקות מבוססות אנטיגן כוללות ELISA וציטומטריית זרימה16. ישנן שתי בדיקות שונות מבוססות פעילות: מבחני פעילות TF חד שלבית ודו-שלבי. הבדיקה החד-שלבית מבוססת על בדיקת קרישה מבוססת פלזמה. הדגימה המכילה TF מתווספת לפלזמה והזמן ליצירת קריש נמדד לאחר הסתיידות מחדש. הבדיקה הדו-שלבית מודדת את דור הדגימות של FXa על ידי הוספת FVII או FVIIa, FX וסידן. רמות FXa נקבעות באמצעות מצע שנבקע על ידי FXa.

הן במבחני פעילות TF חד-שלבית והן בשני שלבים, ריכוז ה-TF נקבע באמצעות עקומה סטנדרטית הנוצרת עם TF רקומביננטי. לבדיקות דו-שלביות יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר לבדיקה החד-שלבית. מחקרים רבים אישרו כי לבדיקות מבוססות פעילות יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר בדיקות מבוססות אנטיגן 17,18,19,20,21. בנוסף, לבדיקת הפעילות הפנימית שלנו יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר לבדיקת פעילות מסחרית22. לאנשים בריאים יש רמות נמוכות מאוד או בלתי ניתנות לגילוי של פעילות EVTF בפלזמה. לעומת זאת, לאנשים עם מצבים פתולוגיים, כגון סרטן, שחמת, אלח דם וזיהום ויראלי, יש רמות ניתנות לזיהוי של פעילות EVTF וזה קשור לפקקת, קרישה תוך וסקולרית מפושטת, חומרת המחלה, ותמותה 23,24,25,26,27,28. כאן, נתאר את בדיקת הפעילות הדו-שלבית של EVTF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

המחקר אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל (פרוטוקול מספר: 14-2108).

1. איסוף דם מתורמים

  1. לאסוף דם שלם באמצעות venipuncture נקי לתוך הווריד antecubital עם מחט 21 גרם. השליכו את 3 מ"ל הדם הראשונים מכיוון שחלק זה של הדם עשוי להכיל TF מתאים פריווסקולריים.
  2. יש לשאוב 2.7 או 1.8 מ"ל (בהתאם לגודל הצינורות) של דם לתוך vacutainer המכיל 3.2% נתרן ציטראט (0.109 mol/L). אין למלא את הצינורות. הפוך בעדינות צינורות מיד לאחר איסוף הדם כדי לפזר את ציטראט נתרן.
  3. הימנע תסיסה אם הצינורות מועברים לפני העיבוד. הכן פלזמה בתוך 2 שעות של איסוף הדם.

2. הכנת פלזמה שליטה שלילית

הערה: אין להניח דגימות על קרח בכל עת לפני ההקפאה הסופית.

  1. הכינו פלסמת בקרה שלילית באמצעות דם מלא ממתנדבים בריאים. מיד לאחר איסוף הדם, להכין פלזמה ללא טסיות כדלקמן.
    1. העברת דגימות דם מצינורות vacutainer לצינורות 15 מ"ל.
    2. דגימות דם צנטריפוגות ב-2,500 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (20-24 מעלות צלזיוס) ללא בלימה.
    3. מעבירים את הסופרנאטנט (פלזמה ענייה בטסיות) לצינור חדש וחוזרים על הספין באותם תנאים.
    4. מעבירים את הסופרנאטנט (פלזמה מדולדלת טסיות) לצינור חדש.
    5. Aliquot את הדגימה לתוך ≥100 μL aliquots. השאירו כ-100 μL בתחתית הצינור.
    6. הקפיאו מיד את הפלזמה המדולדלת מטסיות הדם בטמפרטורה של -80°C (איור 1).

3. הכנת פלזמה שליטה חיובית

הערה: התגובה לליפופוליסכריד משתנה בין אנשים.

  1. העברת דגימות דם מן vacutainers ל 15 מ"ל צינורות.
  2. הכן פלזמה בקרה חיובית באמצעות דם מלא ממתנדבים בריאים מגורה עם lipopolysaccharide (LPS) מ Escherichia coli O111: B4 (10 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 5 שעות ב 37 ° C עם תסיסה.
  3. לאחר 5 שעות דגירה, בצע את השלבים 2.1.2 עד 2.1.6.

4. בידוד שלפוחיות חוץ תאיות מפלזמה

הערה: ייתכן שכדורי EV לא יהיו גלויים. זמן ההפשרה תלוי בנפח הדגימה, אך בדרך כלל אנו מפשירים פלזמה של 100 μL למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.

  1. הפשיר דגימות פלזמה ב 37 ° C.
  2. הוסף 1 מ"ל של HBSA ללא סידן [HBSA-Ca(-)] חיץ [137 mM NaCl, 5.38 mM KCl, 5.55 mM גלוקוז, 10 mM HEPES, 0.1% (w/v) אלבומין בסרום בקר] לכל 100 μL של דגימת פלזמה בצינור 1.5 מ"ל.
  3. דגימות פלזמה צנטריפוגות ב 20,000 × גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C.
  4. שאפו את הסופרנאטנט עד 20 מיקרוליטר מבלי להפריע לכדורית ה-EV.
  5. הרכיבו מחדש את כדורית ה-EV על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ HBSA-Ca(-) לכל צינור, פיפטה למעלה ולמטה במיקום של כדורית ה-EV, וערבול כל צינור לפני צנטריפוגה בפעם השנייה ב-20,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4°C.
  6. שאפו את הסופרנאטנט עד 20 מיקרוליטר מבלי להפריע לכדורית ה-EV.
  7. הרכיבו מחדש את כדורית ה-EV ב-80 מיקרוליטר של HBSA-Ca(-) ופיפטה למעלה ולמטה במיקום של גלולת ה-EV (איור 2).

5. אופציה: בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות באמצעות אולטרה-צנטריפוגה

  1. לאחר שלב 4.3, אספו את הסופרנאטנט והאולטרה-צנטריפוגה ב-100,000 × גרם למשך 70 דקות ב-4°C.
  2. שאפו את הסופרנאטנט עד 20 מיקרוליטר מבלי להפריע לכדורית ה-EV.
  3. הרכיבו מחדש את גלולת ה-EV על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ HBSA-Ca(-) לכל צינור ומערבולת כל צינור לפני אולטרה-צנטריפוגה בפעם השנייה ב-100,000 × גרם למשך 70 דקות ב-4°C.
  4. שאפו את הסופרנאטנט עד 20 מיקרוליטר מבלי להפריע לכדורית ה-EV.
  5. הרכיבו מחדש את גלולת ה-EV ב-80 מיקרוליטר של HBSA-Ca(-).

6. מדידת פעילות גורם רקמת השלפוחית החוץ תאית

הערה: דגימות EV צריך להיות pipeted ולערבל היטב כדי לערבב לפני הוספה לבארות. EDTA-דיסודיום יעכב את היכולת של FXa לבקע את המצע הכרומוגני. לכן, לא ניתן להשתמש ב-EDTA-דיסודיום כתחליף ל-EDTA-tetrasodium בשלב 6.7.

  1. הוסף 40 μL של דגימת EV לשתי בארות של צלחת 96 בארות.
  2. הוסף 11 μL של עכבר מעכב TF IgG אנטי אנושי [(36.4 מיקרוגרם / מ"ל, ריכוז סופי 7.8 מיקרוגרם / מ"ל)] לבאר אחת של דגימת EV ו 11 μL של עכבר בקרה IgG [(36.4 מיקרוגרם / מ"ל, ריכוז סופי 7.8 מיקרוגרם / מ"ל)] לבאר השנייה.
  3. דוגרים על צלחת 96 בארות במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. במהלך זמן הדגירה, הכינו 50 μL/well של תקני TF (0, 0.32, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 10 ו-20 pg/mL) בשכפול באמצעות TF רקומביננטי משומן.
  5. יש להכין את תערובת הגורמים על-ידי ערבוב של 4 מ"ל HBSA עם סידן [HBSA-Ca(+)] [HBSA-Ca(-) + 10 mM CaCl2, ריכוז סופי 10 mM], 800 μL של 900 nM FX ב-HBSA-Ca(+) (ריכוז סופי: 146.4 nM) ו-120 μL של 200 nM FVIIa ב-HBSA-CA(+) (ריכוז סופי: 4.8 nM).
  6. מוסיפים 50 μL של תמיסת תערובת הגורמים לכל באר, מכסים את הצלחת בסרט ודגרים במשך שעתיים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.
  7. לאחר שעתיים, יש להפסיק את ייצור FXa על ידי הוספת 25 μL של חוצץ HBSA ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) [HBSA-Ca(-) + 25 mM EDTA-tetrasodium, ריכוז סופי 5 mM] ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. הרכיבו מחדש את המצע הכרומוגן שנבקע על ידי FXa ל-4mM (הוסיפו 8.7 מ"ל מים מזוקקים לבקבוקון של 25 מ"ג).
  9. הוסף 25 μL של תמיסת המצע הכרומוגנית לכל באר, כסה את הצלחת בסרט ולאחר מכן ברדיד אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור, ודגר במשך 15 דקות ב 37 ° C.
  10. לאחר 15 דקות של דגירה, להסיר בועות עם מחט או על ידי צנטריפוגה ב 1,500 × גרם במשך 1 דקות.
  11. קרא את הצלחת במהירות של 405 ננומטר באמצעות קורא צלחות עם תערובת אחת לפני הקריאה.
  12. המר את דור FXa של כל באר לפעילות TF באמצעות העקומה הסטנדרטית הנוצרת באמצעות TF רקומביננטי משומן.
  13. חישוב יצירת FXa תלוי TF (פעילות EVTF) באמצעות משוואה (1):
    דור FXa תלוי TF (פעילות EVTF [pg/mL]) = יצירת FXa כוללת (שליטה ב-IgG היטב) - דור FXa עצמאי TF (באר IgG נגד TF) (איור 3) (1)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאה מוצלחת נותנת ערך בקרה חיובי של ≥0.5 pg/mL וערך בקרה שלילי של <0.5 pg/mL. עדיף למצוא מגיב LPS גבוה עם פעילות EVTF >1.0 pg/mL לשליטה חיובית. התוצאה המייצגת מראה את פעילות ה-EVTF של כלי רכב חשמליים שבודדו מפלזמה מכל הדם של 11 תורמים בריאים, עם וללא הפעלת LPS (איור 4). שישה מתוך אחד עשר תורמים (תורמים 2, 4, 5, 8, 10, 11) היו מגיבי LPS בינוניים עד גבוהים, ואילו חמישה מתוך אחד עשר תורמים (תורמים 1, 3, 6, 7, 9) היו מגיבים LPS נמוך.

Figure 1
איור 1: הכנת פלזמה מדולדלת טסיות. הנתון שונה מ-Hisada ו-Mackman29. קיצור: PDP = פלזמה מדולדלת טסיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: בידוד של שלפוחיות חוץ-תאיות מפלזמה מדולדלת טסיות. הנתון שונה מ-Hisada ו-Mackman29. קיצורים: PDP = פלזמה מדולדלת טסיות; EVs = שלפוחיות חוץ-תאיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מדידת פעילות גורם רקמת השלפוחית החוץ תאית. הנתון שונה מ-Hisada ו-Mackman29. קיצורים: TF = גורם רקמות; EVs = שלפוחיות חוץ-תאיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: פעילות EVTF של פלזמה מדם שלם של 11 תורמים בריאים, עם וללא הפעלת LPS. הפעלת LPS בוצעה באותו מצב כמו הבקרה החיובית. הבקרה החיובית הייתה ממגיב LPS ידוע בעוד שהתגובות ל- LPS של 11 תורמים בריאים לא היו ידועות בזמן הניסוי. פסים לבנים ושחורים מציינים עם וללא הפעלת LPS, בהתאמה. קיצורים: EVTF = גורם רקמת שלפוחית חוץ-תאית; LPS = lipopolysaccharide. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: סיכום המחקרים המשווים בין בדיקת פעילות EVTF פנימית זו, בדיקת TF ELISA מסחרית ובדיקת פעילות. קיצורים: EVTF = גורם רקמת שלפוחית חוץ-תאית; ELISA = בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן מוצג הפרוטוקול של בדיקת פעילות ה- EVTF הפנימית שלנו. ישנם שלושה שלבים קריטיים בפרוטוקול. בעת בנייה מחדש של כדורית EV, חשוב לבצע פיפטה למעלה ולמטה במיקום של גלולת EV גם אם היא אינה נראית לעין. הרכבה מחדש חלקית של כדורית EV תגרום להערכה שלילית שגויה או הערכת חסר של ערכי פעילות EVTF של הדגימות. שנית, השימוש ב-HBSA-Ca(+) הוא קריטי בשלב 6.5 של הפרוטוקול מכיוון שלא ניתן לייצר דור FXa ללא סידן. שלישית, שימוש ב-EDTA-tetrasodium אך לא ב-EDTA-disodium כדי לעצור את ייצור FXa הוא קריטי מכיוון שהאחרון מעכב את היכולת של FXa לבקע את המצע הכרומוגני.

אנו ממליצים על שיטת האחסון והשימוש הבאה עבור כל מגיב. אנו מאחסנים את מאגרי הבדיקה ואת המצע המשוחזר ב -4 מעלות צלזיוס ומשתמשים בהם שוב ושוב עד שנגמרים להם. אם לא נגמר לנו המצע תוך 2-3 שבועות, אנחנו משליכים אותו כי הוא הופך צהוב. אנו מאחסנים TF רקומביננטי, נוגדנים, FVIIa ו- FX ב -80 ° C וממליצים לעשות aliquots עבור בדיקה אחת כדי למנוע מחזור הקפאה-הפשרה.

במחקר ראשוני, השארנו דגימות פלזמה למשך 9 שעות בטמפרטורת החדר, הקפאנו אותן מחדש בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה, וביצענו את הבדיקה למחרת. כבקרה, הפשרנו את אותה פלזמה והקפאנו אותה מיד. מצאנו כי הדגימה שהושארה במשך 9 שעות בטמפרטורת החדר הראתה ירידה של 16% בפעילות EVTF בהשוואה לדגימה שהופשרה והוקפאה מחדש באופן מיידי (Hisada and Mackman, unpublished data 2017).

בנוסף להבדל בתגובה ל-LPS, ההבדל בריכוז כלי הרכב החשמליים בפלזמה מתורמים בודדים עשוי להסביר את פעילות ה-EVTF השונה של תורמים שונים. ואכן, ראינו כמה וריאציות בריכוזים של כלי רכב חשמליים בפלזמה מדם שלם מגורה LPS (1.9 ± 0.6 × 1010 חלקיקים/מ"ל, n = 6, ממוצע ± סטיית תקן)30.

לבדיקת פעילות EVTF פנימית זו יש מספר תכונות שאין לבדיקות מסחריות. ראשית, הבדיקה משתמשת בנוגדן אנטי-TF כדי להבדיל בין דור FXa תלוי TF לבין דור FXa שאינו תלוי ב-TF. נטען כי שלושה מבחני פעילות מסחרית מודדים את פעילות TF בפלזמה, אך אף אחד מהם אינו משתמש בנוגדנים נגד TF16. לכן, בדיקות מסחריות אלה פשוט מודדות את סך כל דור FXa אך לא דור FXa תלוי TF. שנית, אנו משתמשים ב-2.4 ננומטר של FVIIa (הריכוז הסופי בתגובה) כדי למזער את יצירת FXa שאינו תלוי ב-TF על ידי FVIIa. בדיקת פעילות מסחרית אחת משתמשת ב- 12 ננומטר של FVIIa בתגובה, מה שנותן רקע גבוה22. ואכן, FVIIa מפעיל FX באופן ליניארי בהתאם לריכוז FVIIa בהיעדר TF31. סיכמנו את המחקרים שהשוו בין בדיקת פעילות EVTF פנימית זו לבין TF ELISA מסחרית ובדיקת פעילות בטבלה 1.

מוצעים ארבעה סיווגי תגובה של פעילות EVTF עבור פלזמה ענייה בטסיות ציטרציה: אפס (0 עד <0.5 pg/mL); חלש (0.5 עד <1.0 pg/mL), בינוני (1.0 עד <2.0 pg/mL) וחזק (≥2.0 pg/mL)23. יש לציין כי נוגדי קרישה שונים משפיעים על תוצאות בדיקות הפעילות של EVTF. לדוגמה, רמות גבוהות יותר של פעילות EVTF נצפו בשימוש בהפרין לאחר גירוי LPS בהשוואה לנתרן ציטראט (תורם A: 4.6 (ציטראט) לעומת 28.6 (הפרין) pg/mL ותורם B: 3.4 (ציטראט) לעומת 26.0 (הפרין) pg/mL, בהתאמה, Hisada ו- Mackman נתונים שלא פורסמו 2017). לעומת זאת, רמות נמוכות יותר של פעילות EVTF נצפו בשימוש ב- EDTA לאחר גירוי LPS בהשוואה לנתרן ציטראט (תורם C: 3.9 (ציטראט) לעומת 1.4 (EDTA) pg/mL, תורם D: 3.8 (ציטראט) לעומת 0.4 (EDTA) pg/mL, בהתאמה, Tatsumi ו- Mackman נתונים שלא פורסמו 2016). תוצאות אלה מצביעות על כך שנתוני פעילות EVTF אינם ברי השוואה כאשר משתמשים בנוגדי קרישה שונים.

יש כמה מגבלות לשיטה. מקדם השונות (CV) גבוה יחסית בהשוואה לבדיקות קליניות. ואכן, קורות החיים של הבקרה החיובית בשבעה מחקרים עצמאיים היו 24%17,29. בידוד כלי רכב חשמליים באמצעות כדורי צנטריפוגה לא רק לרכבים חשמליים אלא גם לפסולת סלולרית. בעבר ניתחנו את הגלולה של פלזמה עשירה בטסיות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת וצפינו בטסיות דם, רכבים חשמליים ופסולת תאית32. אנו משתמשים ברוטור בעל זווית קבועה ולא חווינו רוטור מתנדנד החוצה עבור צנטריפוגה של 20,000 × גרם. לאחרונה מצאנו כי כלי רכב חשמליים קטנים שניתן להניף עם 100,000 גרם × אך לא עם 20,000 × גרם הם בעלי פעילות EVTF בחולים עם סרטן הלבלב ו- COVID-1930. זה מצביע על כך שפרוטוקול זה אינו מודד את פעילות EVTF מכלי רכב חשמליים קטנים, כגון אקסוזומים. יש לציין כי אקסוזומים הם כלי רכב חשמליים עשירים בספינגומיילין ונוכחות של אקסוזומים נושאי TF דווחה 30,33,34,35. אנו ממליצים על כדורי EV בפלזמה באמצעות 100,000 × גרם כדי לקבוע בצורה מדויקת יותר את הכמות הכוללת של פעילות EVTF בדגימה. יש לציין שזה דורש אולטרה-צנטריפוגה וזמן בדיקה ארוך יותר מכיוון שזמן הצנטריפוגה גדל מ-15 דקות ל-70 דקות.

שיטה זו יכולה להיות מיושמת על דגימות פלזמה מכל סוג של מחלה. פעילות EVTF קשורה לחומרת המחלה ולהישרדות בחולים עם מחלות שונות, כולל סרטן, COVID-19, זיהום חיידקי ושחמתהכבד 23,26,27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) ופרופסורת ג'ון סי פארקר (N.M). ברצוננו להודות לגב' סיירה ארצ'יבלד על הערותיה המועילות

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge any company N/A We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).
1.5 mL tube for ultracentrifuge any company N/A We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)
15 mL tube any company N/A We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter BD 367281
96-well plate any company N/A We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).
BD Vacutainer Citrate Tubes BD 363083
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A9418
Calcium chloride Fisher Scientific C69-500
Centrifuge for 1.5 mL tube any company N/A We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge for 15 mL tube any company N/A We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G7021
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate Sigma Aldrich E6511
Hepes Sigma Aldrich H4034
Human FVIIa Enzyme Research Laboratory HFVIIa The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Human FX Enzyme Research Laboratory HFX1010 The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 Fisher Scientific 550252
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 Sigma Aldrich L2630 There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.
Mouse IgG Sigma Aldrich I5381
Pefachrome FXa 8595 Enzyme Research Laboratory 085-27
Plate reader any company N/A We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin Siemens 10873566
Sodium chloride  Fisher Scientific S271-500
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima TLX
Ultracentrifuge rotor Beckman Coulter TLA-55

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grover, S. P., Mackman, N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).
  2. Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H. The local phospholipid environment modulates the activation of blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6556-6563 (2007).
  3. Tavoosi, N., et al. Molecular determinants of phospholipid synergy in blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23247-23253 (2011).
  4. Wang, J., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. M. Sphingomyelin encrypts tissue factor: ATP-induced activation of A-SMase leads to tissue factor decryption and microvesicle shedding. Blood Advances. 1 (13), 849-862 (2017).
  5. Kornhuber, J., Rhein, C., Muller, C. P., Muhle, C. Secretory sphingomyelinase in health and disease. Biological Chemistry. 396 (6-7), 707-736 (2015).
  6. Versteeg, H. H., Ruf, W. Tissue factor coagulant function is enhanced by protein-disulfide isomerase independent of oxidoreductase activity. Journal of Biological Chemistry. 282 (35), 25416-25424 (2007).
  7. Reinhardt, C., et al. Protein disulfide isomerase acts as an injury response signal that enhances fibrin generation via tissue factor activation. Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 1110-1122 (2008).
  8. Langer, F., et al. Rapid activation of monocyte tissue factor by antithymocyte globulin is dependent on complement and protein disulfide isomerase. Blood. 121 (12), 2324-2335 (2013).
  9. Bogdanov, V. Y., et al. Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein. Nature Medicine. 9 (4), 458-462 (2003).
  10. Mackman, N. Alternatively spliced tissue factor - one cut too many. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 5-8 (2007).
  11. Censarek, P., Bobbe, A., Grandoch, M., Schror, K., Weber, A. A. Alternatively spliced human tissue factor (asHTF) is not pro-coagulant. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 11-14 (2007).
  12. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  13. Osterud, B., Bjorklid, E. Tissue factor in blood cells and endothelial cells. Frontiers in Bioscience (Elite Edition). 4 (1), 289-299 (2012).
  14. Hisada, Y., Mackman, N. Cancer cell-derived tissue factor-positive extracellular vesicles: biomarkers of thrombosis and survival. Current Opinion in Hematology. 26 (5), 349-356 (2019).
  15. Vatsyayan, R., Kothari, H., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. 4-Hydroxy-2-nonenal enhances tissue factor activity in human monocytic cells via p38 mitogen-activated protein kinase activation-dependent phosphatidylserine exposure. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (7), 1601-1611 (2013).
  16. Mackman, N., Sachetto, A. T. A., Hisada, Y. Measurement of tissue factor-positive extracellular vesicles in plasma: strengths and weaknesses of current methods. Current Opinion in Hematology. 29 (5), 266-274 (2022).
  17. Lee, R. D., et al. Pre-analytical and analytical variables affecting the measurement of plasma-derived microparticle tissue factor activity. Thrombosis Research. 129 (1), 80-85 (2012).
  18. Claussen, C., et al. Microvesicle-associated tissue factor procoagulant activity for the preoperative diagnosis of ovarian cancer. Thrombosis Research. 141, 39-48 (2016).
  19. Mackman, N., Hisada, Y., Archibald, S. J., et al. Tissue factor and its procoagulant activity on cancer-associated thromboembolism in pancreatic cancer: Comment by Mackman et al. Cancer Science. 113 (5), 1885-1887 (2022).
  20. Sachetto, A. T. A., et al. Evaluation of four commercial ELISAs to measure tissue factor in human plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100133 (2023).
  21. Archibald, S. J., Hisada, Y., Bae-Jump, V. L., Mackman, N. Evaluation of a new bead-based assay to measure levels of human tissue factor antigen in extracellular vesicles in plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 6 (2), e12677 (2022).
  22. Tatsumi, K., et al. Evaluation of a new commercial assay to measure microparticle tissue factor activity in plasma: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (11), 1932-1934 (2014).
  23. Hisada, Y., et al. Measurement of microparticle tissue factor activity in clinical samples: A summary of two tissue factor-dependent FXa generation assays. Thrombosis Research. 139, 90-97 (2016).
  24. Tatsumi, K., Hisada, Y., Connolly, A. F., Buranda, T., Mackman, N. Patients with severe orthohantavirus cardiopulmonary syndrome due to Sin Nombre Virus infection have increased circulating extracellular vesicle tissue factor and an activated coagulation system. Thrombosis Research. 179, 31-33 (2019).
  25. Schmedes, C. M., et al. Circulating Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity During Orthohantavirus Infection Is Associated With Intravascular Coagulation. Journal of Infectious Diseases. 222 (8), 1392-1399 (2020).
  26. Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-Brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
  27. Campbell, R. A., et al. Comparison of the coagulopathies associated with COVID-19 and sepsis. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), e12525 (2021).
  28. Guervilly, C., et al. Dissemination of extreme levels of extracellular vesicles: tissue factor activity in patients with severe COVID-19. Blood Advances. 5 (3), 628-634 (2021).
  29. Hisada, Y., Mackman, N. Measurement of tissue factor activity in extracellular vesicles from human plasma samples. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3 (1), 44-48 (2019).
  30. Sachetto, A. T. A., et al. Tissue factor activity of small and large extracellular vesicles in different diseases. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100124 (2023).
  31. Bom, V. J., Bertina, R. M. The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII. Biochemical Journal. 265 (2), 327-336 (1990).
  32. Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue factor activity is increased in a combined platelet and microparticle sample from cancer patients. Thrombosis Research. 122 (5), 604-609 (2008).
  33. Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 47 (2021).
  34. Garnier, D., et al. Cancer cells induced to express mesenchymal phenotype release exosome-like extracellular vesicles carrying tissue factor. Journal of Biological Chemistry. 287 (52), 43565-43572 (2012).
  35. Park, J. A., et al. Tissue factor-bearing exosome secretion from human mechanically stimulated bronchial epithelial cells in vitro and in vivo. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (6), 1375-1383 (2012).

Tags

רפואה גיליון 202
בדיקת פעילות גורם רקמת שלפוחית חוץ-תאית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hisada, Y., Mackman, N.… More

Hisada, Y., Mackman, N. Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity Assay. J. Vis. Exp. (202), e65840, doi:10.3791/65840 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter