Summary
Här beskriver vi en intern extracellulär vesikelvävnadsfaktoraktivitetsanalys. Aktivitetsbaserade analyser och antigenbaserade analyser har använts för att mäta vävnadsfaktor i extracellulära vesiklar från humana plasmaprover. Aktivitetsbaserade analyser har högre sensitivitet och specificitet än antigenbaserade analyser.
Abstract
Vävnadsfaktor (TF) är en transmembranreceptor för faktor (F) VII och FVIIa. TF/FVIIa-komplexet initierar koagulationskaskaden genom att aktivera både FIX och FX. TF frisätts från celler till cirkulationen i form av extracellulära vesiklar (EV). Nivån av TF-positiva (+) EV är förhöjda vid olika sjukdomar, inklusive cancer, bakterie- och virusinfektioner och cirros, och är förknippad med trombos, disseminerad intravaskulär koagulation, sjukdomens svårighetsgrad och mortalitet. Det finns två sätt att mäta TF+ EV i plasma: antigen- och aktivitetsbaserade analyser. Data tyder på att aktivitetsbaserade analyser har högre sensitivitet och specificitet än antigenbaserade analyser. Detta dokument beskriver vår interna EVTF-aktivitetsanalys baserad på en tvåstegs FXa-genereringsanalys. FVIIa, FX och kalcium tillsätts till de TF+ EV-innehållande proverna för att generera FXa i närvaro och frånvaro av anti-TF-antikroppar för att skilja TF-beroende FXa-generering från TF-oberoende FXa-generering. Ett kromogent substrat klyvt av FXa används för att bestämma FXa-nivån, medan en standardkurva genererad med en relipiderad rekombinant TF används för bestämning av TF-koncentrationen. Denna interna EVTF-aktivitetsanalys har högre sensitivitet och specificitet än en kommersiell TF-aktivitetsanalys.
Introduction
Blodkoagulationen initieras med bindning av faktor (F) VII/VIIa till vävnadsfaktor (TF)1. TF/FVIIa-komplexet aktiverar både FIX och FX för att aktivera blodkoagulation1. Det finns två former av membranbunden TF i full längd: krypterad och aktiv. Dessutom finns det en alternativt splitsad form av TF (asTF). Sphingomyelin och fosfatidylkolin i cellmembranets yttre bipacksedel upprätthåller TF i krypterat tillstånd 2,3,4. När celler aktiveras eller skadas överför fosfolipidförvrängning fosfatidylserin och andra negativt laddade fosfolipider till det yttre bipacksedeln1. Aktiveringen av celler resulterar också i translokation av surt sfingomyelinas till den yttre bipacksedeln där det bryter ned sfingomyelin till ceramid5. Dessa två mekanismer konverterar krypterad TF till den aktiva formen. Det föreslås också att proteindisulfidisomeras medierar disulfidbindningsbildning mellan Cys186 och Cys209 i krypterad TF, vilket resulterar i dekryptering av TF 6,7,8. asTF finns också i cirkulationen men saknar den transmembrana domänen och är därför löslig 9,10. Viktigt är att asTF har mycket låga nivåer av prokoagulerande aktivitet jämfört med aktiv TF10,11 i full längd.
Extracellulära vesiklar (EV) frigörs från vilande, aktiverade och döende värdceller, såväl som cancerceller12. EV uttrycker proteiner från sina föräldraceller12. Aktiva TF-bärande EV frisätts från aktiverade monocyter, endotelceller och tumörceller i cirkulationen 13,14,15. Nivåer av TF i plasma kan mätas med aktivitets- och antigenbaserade analyser. Antigenbaserade analyser inkluderar ELISA och flödescytometri16. Det finns två olika aktivitetsbaserade analyser: enstegs och tvåstegs TF-aktivitetsanalyser. Enstegsanalysen är baserad på en plasmabaserad koagulationsanalys. Det TF-innehållande provet tillsätts till plasma och tiden för att bilda en koagel mäts efter omkalkning. Tvåstegsanalysen mäter FXa-generering av samples genom att tillsätta FVII eller FVIIa, FX och kalcium. FXa-nivåerna bestäms med hjälp av ett substrat som klyvs av FXa.
I både en- och tvåstegs TF-aktivitetsanalyser bestäms TF-koncentrationen med hjälp av en standardkurva genererad med rekombinant TF. Tvåstegsanalyser har högre sensitivitet och specificitet än enstegsanalysen. Många studier har bekräftat att aktivitetsbaserade analyser har högre sensitivitet och specificitet än antigenbaserade analyser 17,18,19,20,21. Dessutom har vår interna aktivitetsanalys högre sensitivitet och specificitet än en kommersiell aktivitetsanalys22. Friska individer har mycket låga eller odetekterbara nivåer av EVTF-aktivitet i plasma. Däremot har individer med patologiska tillstånd, såsom cancer, cirros, sepsis och virusinfektion, detekterbara nivåer av EVTF-aktivitet och detta är associerat med trombos, disseminerad intravaskulär koagulation, sjukdomens svårighetsgrad och dödlighet 23,24,25,26,27,28. Här kommer vi att beskriva denna interna tvåstegs EVTF-aktivitetsanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen godkändes av Institutional Review Board vid University of North Carolina i Chapel Hill (protokollnummer: 14-2108).
1. Insamling av blod från givare
- Samla upp helblod med ren venpunktion i venen antecubital med en 21 G nål. Kassera de första 3 ml blod eftersom denna del av blodet kan innehålla TF från perivaskulära celler.
- Dra upp 2,7 eller 1,8 ml (beroende på rörens storlek) blod i en vakuum som innehåller 3,2 % natriumcitrat (0,109 mol/L). Över- eller underfyll inte rören. Vänd försiktigt upp och ner på rören omedelbart efter bloduppsamlingen för att dispergera natriumcitratet.
- Undvik omrörning om rören transporteras före bearbetning. Bered plasma inom 2 timmar efter blodinsamling.
2. Beredning av negativ kontrollplasma
OBS: Samples bör inte placeras på is när som helst före den slutliga frysningen.
- Bered plasma med negativ kontroll med helblod från friska frivilliga. Omedelbart efter bloduppsamling bereds trombocytfri plasma enligt följande.
- Överför blodprover från vakuumrören till 15 ml rör.
- Centrifugera blodproverna vid 2 500 × g i 15 minuter i rumstemperatur (20–24 °C) utan broms.
- Överför supernatanten (blodplättsfattig plasma) till ett nytt rör och upprepa centrifugeringen under samma förhållanden.
- Överför supernatanten (blodplättstömd plasma) till ett nytt rör.
- Fördela provet i alikvoter på ≥100 μl. Lämna cirka 100 μL i botten av röret.
- Frys omedelbart den trombocytutarmade plasman vid −80 °C (figur 1).
3. Beredning av plasma med positiv kontroll
OBS: Responsen på lipopolysackarid varierar mellan individer.
- Överför blodprover från vakuumrören till 15 ml rör.
- Bered plasma med positiv kontroll med helblod från friska frivilliga stimulerade med lipopolysackarid (LPS) från Escherichia coli O111:B4 (10 μg/ml) i 5 timmar vid 37 °C med omrörning.
- Efter 5 timmars inkubation följer du stegen 2.1.2 till 2.1.6.
4. Isolering av extracellulära vesiklar från plasma
OBS: EV-pellets kanske inte syns. Avfrostningstiden är beroende av provvolymen, men vi tinar vanligtvis upp 100 μL plasma i 30 minuter vid 37 °C.
- Tina plasmaprover vid 37 °C.
- Tillsätt 1 ml HBSA utan kalcium [HBSA-Ca(-)] buffert [137 mM NaCl, 5,38 mM KCl, 5,55 mM glukos, 10 mM HEPES, 0,1 % (vikt/volym) bovint serumalbumin] till varje 100 μl plasmaprov i ett 1,5 ml rör.
- Centrifugera plasmaproverna vid 20 000 × g i 15 minuter vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten ner till 20 μL utan att störa EV-pelleten.
- Bered EV-pelleten genom att tillsätta 1 ml HBSA-Ca(-)-buffert till varje rör, pipettera upp och ner på platsen för EV-pelleten och virvla varje rör innan centrifugering en andra gång vid 20 000 × g i 15 minuter vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten ner till 20 μL utan att störa EV-pelleten.
- Bered EV-pelleten i 80 μL HBSA-Ca(-) och pipettera upp och ner på platsen för EV-pelleten (figur 2).
5. Alternativ: Isolering av små extracellulära vesiklar med hjälp av ultracentrifug
- Efter steg 4.3 samlas supernatanten och ultracentrifugen upp vid 100 000 × g i 70 minuter vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten ner till 20 μL utan att störa EV-pelleten.
- Bered EV-pelleten genom att tillsätta 1 ml HBSA-Ca(-)-buffert till varje rör och virvla varje rör före ultracentrifugering en andra gång vid 100 000 × g i 70 minuter vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten ner till 20 μL utan att störa EV-pelleten.
- Bered EV-pelleten i 80 μl HBSA-Ca(-).
6. Mätning av extracellulär vesikelvävnadsfaktoraktivitet
OBS: EV-prover bör pipetteras och virvlas väl för att blandas innan de läggs till brunnar. EDTA-dinatrium hämmar FXa:s förmåga att klyva det kromogena substratet. EDTA-dinatrium kan därför inte användas som ersättning för EDTA-tetranatrium i steg 6.7.
- Tillsätt 40 μl av ett EV-prov till två brunnar på en 96-hålars platta.
- Tillsätt 11 μL av en hämmande mus mot humant TF IgG [(36,4 μg/ml, slutlig koncentration 7,8 μg/ml)] till en brunn i ett EV-prov och 11 μL IgG från kontrollmusen [(36,4 μg/ml, slutlig koncentration 7,8 μg/ml)] till den andra brunnen.
- Inkubera plattan med 96 brunnar i 15 minuter i rumstemperatur.
- Under inkubationstiden bereds 50 μL/brunn av TF-standarder (0, 0,32, 0,63, 1,25, 2,5, 5, 10 och 20 pg/ml) i duplikat med hjälp av relipiderad rekombinant TF.
- Bered faktorblandningen genom att blanda 4 ml HBSA med kalcium [HBSA-Ca(+)] [HBSA-Ca(-) + 10 mM CaCl2, slutlig koncentration 10 mM], 800 μl 900 nM FX i HBSA-Ca(+) (slutlig koncentration: 146,4 nM) och 120 μl 200 nM FVIIa i HBSA-CA(+) (slutlig koncentration: 4,8 nM).
- Tillsätt 50 μl av faktorblandningslösningen till varje brunn, täck plattan med folie och inkubera i 2 timmar i en inkubator vid 37 °C.
- Efter 2 timmar avbryts genereringen av FXa genom tillsats av 25 μl HBSA-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) buffert [HBSA-Ca(-) + 25 mM EDTA-tetranatrium, slutlig koncentration 5 mM] och inkuberas i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Bered det kromogena substratet som klyvs av FXa till 4 mM (tillsätt 8,7 ml destillerat vatten till en 25 mg injektionsflaska).
- Tillsätt 25 μl av den kromogena substratlösningen till varje brunn, täck plattan med film och sedan med aluminiumfolie för att skydda den från ljus och inkubera i 15 minuter vid 37 °C.
- Efter 15 minuters inkubation avlägsnas bubblorna med en nål eller genom centrifugering vid 1 500 × g i 1 minut.
- Läs av plattan vid 405 nm med en plattläsare med en blandning innan du läser.
- Konvertera FXa-genereringen för varje brunn till TF-aktivitet med hjälp av standardkurvan som genereras med hjälp av relipiderad rekombinant TF.
- Beräkna TF-beroende FXa-generering (EVTF-aktivitet) med hjälp av ekvation (1):
TF-beroende FXa-generering (EVTF-aktivitet [pg/ml]) = Total FXa-generering (kontroll-IgG-brunn) - TF-oberoende FXa-generering (anti-TF IgG-brunn) (figur 3) (1)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett lyckat resultat ger ett positivt kontrollvärde på ≥0,5 pg/ml och ett negativt kontrollvärde på <0,5 pg/ml. Det är bäst att hitta en hög LPS-responder med >1.0 pg/ml EVTF-aktivitet för en positiv kontroll. Det representativa resultatet visar EVTF-aktiviteten hos EV isolerade från plasma från helblod från 11 friska donatorer, med och utan LPS-aktivering (Figur 4). Sex av elva donatorer (donator 2, 4, 5, 8, 10, 11) svarade medelhögt till mycket LPS, medan fem av elva donatorer (donator 1, 3, 6, 7, 9) hade låg LPS-respons.
Figur 1: Beredning av trombocytutarmad plasma. Figuren modifierades från Hisada och Mackman29. Förkortning: PDP = platelet-deppled plasma. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Isolering av extracellulära vesiklar från trombocytutarmad plasma. Figuren modifierades från Hisada och Mackman29. Förkortningar: PDP = trombocytutarmad plasma; EV = extracellulära vesiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Mätning av extracellulär vesikelvävnadsfaktoraktivitet. Figuren modifierades från Hisada och Mackman29. Förkortningar: TF = vävnadsfaktor; EV = extracellulära vesiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: EVTF-aktivitet i plasma från helblod från 11 friska givare, med och utan LPS-aktivering. LPS-aktivering utfördes under samma förhållanden som den positiva kontrollen. Den positiva kontrollen kom från en känd LPS-responder medan responsen på LPS från 11 friska donatorer inte var känd vid tidpunkten för experimentet. Vita och svarta staplar indikerar med respektive utan LPS-aktivering. Förkortningar: EVTF = extracellulär vesikelvävnadsfaktor; LPS = lipopolysackarid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: En sammanfattning av de studier som jämför denna interna EVTF-aktivitetsanalys, en kommersiell TF ELISA och en aktivitetsanalys. Förkortningar: EVTF = extracellulär vesikelvävnadsfaktor; ELISA = enzymkopplad immunadsorberande analys. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenteras protokollet för vår interna EVTF-aktivitetsanalys. Det finns tre kritiska steg i protokollet. Vid beredning av EV-pelleten, det är viktigt att pipettera upp och ner på platsen för EV-pelleten även om den inte är synlig. Ofullständig beredning av EV-pelleten kommer att resultera i ett falskt negativt eller underskattning av EVTF-aktivitetsvärdena för proverna. För det andra är det viktigt att använda HBSA-Ca(+) i protokollsteg 6.5 eftersom FXa-generering inte kan genereras utan kalcium. För det tredje är det viktigt att använda EDTA-tetranatrium men inte EDTA-dinatrium för att stoppa FXa-genereringen eftersom det senare hämmar FXa:s förmåga att klyva det kromogena substratet.
Vi rekommenderar följande lagrings- och användningsmetod för varje reagens. Vi förvarar analysbuffertar och det rekonstituerade substratet vid 4 °C och använder dem upprepade gånger tills de tar slut. Om vi inte tar slut på substratet inom 2-3 veckor kasserar vi det eftersom det blir gult. Vi lagrar rekombinant TF, antikroppar, FVIIa och FX vid -80 °C och rekommenderar att man gör alikvoter för en analys för att undvika en frys-upptiningscykel.
I en förstudie lämnade vi plasmaprover i 9 timmar i rumstemperatur, frös om dem vid -80 °C över natten och utförde analysen nästa dag. Som en kontroll tinade vi upp samma plasma och frös om den omedelbart. Vi fann att provet som lämnades i 9 timmar vid rumstemperatur hade en 16 % minskning av EVTF-aktiviteten jämfört med det som tinades och frystes om omedelbart (Hisada och Mackman, opublicerade data 2017).
Förutom skillnaden i respons på LPS kan skillnaden i koncentrationen av EV i plasma från enskilda donatorer förklara de olika EVTF-aktiviteterna hos olika donatorer. Vi observerade vissa variationer i koncentrationerna av EV i plasma från LPS-stimulerat helblod (1,9 ± 0,6 × 1010 partiklar/ml, n = 6, medelvärde ± standardavvikelse)30.
Denna interna EVTF-aktivitetsanalys har flera funktioner som kommersiella analyser inte har. För det första använder analysen en anti-TF-antikropp för att skilja TF-beroende FXa-generering från TF-oberoende FXa-generering. Tre kommersiella aktivitetsanalyser påstås mäta TF-aktivitet i plasma, men ingen av dem använder anti-TF-antikroppar16. Därför mäter dessa kommersiella analyser helt enkelt den totala FXa-genereringen men inte den TF-beroende FXa-genereringen. För det andra använder vi 2,4 nM FVIIa (den slutliga koncentrationen i reaktionen) för att minimera TF-oberoende FXa-generering av FVIIa. En kommersiell aktivitetsanalys använder 12 nM FVIIa i reaktionen, vilket ger en hög bakgrundsbild22. FVIIa aktiverar FX linjärt beroende på FVIIa-koncentrationen i frånvaro av TF31. Vi sammanfattade studierna som jämförde denna interna EVTF-aktivitetsanalys och kommersiell TF ELISA och en aktivitetsanalys i tabell 1.
Fyra responsklassificeringar av EVTF-aktivitet för citrerad trombocytfattig plasma föreslås: noll (0 till <0,5 pg/ml); svag (0,5 till <1,0 pg/ml), måttlig (1,0 till <2,0 pg/ml) och stark (≥2,0 pg/ml)23. Noterbart är att olika antikoagulantia påverkar resultaten av EVTF-aktivitetsanalyser. Till exempel observerades högre nivåer av EVTF-aktivitet vid användning av heparin efter LPS-stimulering jämfört med natriumcitrat (donator A: 4,6 (citrat) vs 28,6 (heparin) pg/ml och donator B: 3,4 (citrat) vs 26,0 (heparin) pg/ml, Hisada respektive Mackman opublicerade data 2017). Däremot observerades lägre nivåer av EVTF-aktivitet vid användning av EDTA efter LPS-stimulering jämfört med natriumcitrat (donator C: 3,9 (citrat) vs 1,4 (EDTA) pg/ml, donator D: 3,8 (citrat) vs 0,4 (EDTA) pg/ml, Tatsumi respektive Mackman opublicerade data 2016). Dessa resultat indikerar att EVTF-aktivitetsdata inte är jämförbara när olika antikoagulantia används.
Det finns några begränsningar för metoden. Variationskoefficienten (CV) är relativt hög jämfört med kliniska analyser. Faktum är att CV för den positiva kontrollen i sju oberoende studier var 24%17,29. Isolering av elfordon med hjälp av centrifugeringspellets, inte bara elfordon utan även cellulärt skräp. Vi har tidigare analyserat pelleten av blodplättsrik plasma genom transmissionselektronmikroskopi och observerade trombocyter, EV och cellulärt skräp32. Vi använder en rotor med fast vinkel och har inte upplevt en utsvängbar rotor för 20 000 × g centrifugering. Vi fann nyligen att små elfordon som kan pelleteras med 100 000 × g men inte med 20 000 × g har EVTF-aktivitet hos patienter med bukspottkörtelcancer och COVID-1930. Detta indikerar att detta protokoll inte mäter EVTF-aktivitet från små EV:er, såsom exosomer. Noterbart är att exosomer är sfingomyelrika EV och förekomsten av TF-bärande exosomer har rapporterats 30,33,34,35. Vi rekommenderar pelletering av EV i plasma med 100 000 × g för att mer exakt bestämma den totala mängden EVTF-aktivitet i sample. Observera att det kräver en ultracentrifug och en längre analystid eftersom centrifugeringstiden ökar från 15 min till 70 min.
Denna metod kan tillämpas på plasmaprover från alla typer av sjukdomar. EVTF-aktivitet är förknippad med sjukdomens svårighetsgrad och överlevnad hos patienter med olika sjukdomar, inklusive cancer, COVID-19, bakteriell infektion och cirros 23,26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inga konkurrerande intressen att redovisa.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) och John C. Parker-professuren (N.M.). Vi vill tacka Sierra J. Archibald för hennes hjälpsamma kommentarer
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
| 1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
| 15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
| 21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
| 96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
| Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
| Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
| Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |
References
- Grover, S. P., Mackman, N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).
- Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H. The local phospholipid environment modulates the activation of blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6556-6563 (2007).
- Tavoosi, N., et al. Molecular determinants of phospholipid synergy in blood clotting. Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23247-23253 (2011).
- Wang, J., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. M. Sphingomyelin encrypts tissue factor: ATP-induced activation of A-SMase leads to tissue factor decryption and microvesicle shedding. Blood Advances. 1 (13), 849-862 (2017).
- Kornhuber, J., Rhein, C., Muller, C. P., Muhle, C. Secretory sphingomyelinase in health and disease. Biological Chemistry. 396 (6-7), 707-736 (2015).
- Versteeg, H. H., Ruf, W. Tissue factor coagulant function is enhanced by protein-disulfide isomerase independent of oxidoreductase activity. Journal of Biological Chemistry. 282 (35), 25416-25424 (2007).
- Reinhardt, C., et al. Protein disulfide isomerase acts as an injury response signal that enhances fibrin generation via tissue factor activation. Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 1110-1122 (2008).
- Langer, F., et al. Rapid activation of monocyte tissue factor by antithymocyte globulin is dependent on complement and protein disulfide isomerase. Blood. 121 (12), 2324-2335 (2013).
- Bogdanov, V. Y., et al. Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein. Nature Medicine. 9 (4), 458-462 (2003).
- Mackman, N. Alternatively spliced tissue factor - one cut too many. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 5-8 (2007).
- Censarek, P., Bobbe, A., Grandoch, M., Schror, K., Weber, A. A. Alternatively spliced human tissue factor (asHTF) is not pro-coagulant. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 11-14 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Osterud, B., Bjorklid, E. Tissue factor in blood cells and endothelial cells. Frontiers in Bioscience (Elite Edition). 4 (1), 289-299 (2012).
- Hisada, Y., Mackman, N. Cancer cell-derived tissue factor-positive extracellular vesicles: biomarkers of thrombosis and survival. Current Opinion in Hematology. 26 (5), 349-356 (2019).
- Vatsyayan, R., Kothari, H., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. 4-Hydroxy-2-nonenal enhances tissue factor activity in human monocytic cells via p38 mitogen-activated protein kinase activation-dependent phosphatidylserine exposure. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (7), 1601-1611 (2013).
- Mackman, N., Sachetto, A. T. A., Hisada, Y. Measurement of tissue factor-positive extracellular vesicles in plasma: strengths and weaknesses of current methods. Current Opinion in Hematology. 29 (5), 266-274 (2022).
- Lee, R. D., et al. Pre-analytical and analytical variables affecting the measurement of plasma-derived microparticle tissue factor activity. Thrombosis Research. 129 (1), 80-85 (2012).
- Claussen, C., et al. Microvesicle-associated tissue factor procoagulant activity for the preoperative diagnosis of ovarian cancer. Thrombosis Research. 141, 39-48 (2016).
- Mackman, N., Hisada, Y., Archibald, S. J., et al. Tissue factor and its procoagulant activity on cancer-associated thromboembolism in pancreatic cancer: Comment by Mackman et al. Cancer Science. 113 (5), 1885-1887 (2022).
- Sachetto, A. T. A., et al. Evaluation of four commercial ELISAs to measure tissue factor in human plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100133 (2023).
- Archibald, S. J., Hisada, Y., Bae-Jump, V. L., Mackman, N. Evaluation of a new bead-based assay to measure levels of human tissue factor antigen in extracellular vesicles in plasma. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 6 (2), e12677 (2022).
- Tatsumi, K., et al. Evaluation of a new commercial assay to measure microparticle tissue factor activity in plasma: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (11), 1932-1934 (2014).
- Hisada, Y., et al. Measurement of microparticle tissue factor activity in clinical samples: A summary of two tissue factor-dependent FXa generation assays. Thrombosis Research. 139, 90-97 (2016).
- Tatsumi, K., Hisada, Y., Connolly, A. F., Buranda, T., Mackman, N. Patients with severe orthohantavirus cardiopulmonary syndrome due to Sin Nombre Virus infection have increased circulating extracellular vesicle tissue factor and an activated coagulation system. Thrombosis Research. 179, 31-33 (2019).
- Schmedes, C. M., et al. Circulating Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity During Orthohantavirus Infection Is Associated With Intravascular Coagulation. Journal of Infectious Diseases. 222 (8), 1392-1399 (2020).
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-Brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Campbell, R. A., et al. Comparison of the coagulopathies associated with COVID-19 and sepsis. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), e12525 (2021).
- Guervilly, C., et al. Dissemination of extreme levels of extracellular vesicles: tissue factor activity in patients with severe COVID-19. Blood Advances. 5 (3), 628-634 (2021).
- Hisada, Y., Mackman, N. Measurement of tissue factor activity in extracellular vesicles from human plasma samples. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3 (1), 44-48 (2019).
- Sachetto, A. T. A., et al. Tissue factor activity of small and large extracellular vesicles in different diseases. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100124 (2023).
- Bom, V. J., Bertina, R. M. The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII. Biochemical Journal. 265 (2), 327-336 (1990).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue factor activity is increased in a combined platelet and microparticle sample from cancer patients. Thrombosis Research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 47 (2021).
- Garnier, D., et al. Cancer cells induced to express mesenchymal phenotype release exosome-like extracellular vesicles carrying tissue factor. Journal of Biological Chemistry. 287 (52), 43565-43572 (2012).
- Park, J. A., et al. Tissue factor-bearing exosome secretion from human mechanically stimulated bronchial epithelial cells in vitro and in vivo. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (6), 1375-1383 (2012).
