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Encyclopedia of Experiments

Mesures de la zone musculaire de C. elegans : une méthode normalisée pour quantifier la morphologie musculaire striée

Overview

C. elegans ont deux types de muscles, le sarcome unique et le sarcome multiple, ou les muscles striés.  Cette vidéo décrit l’agencement des muscles striés de la paroi du corps, qui sont responsables de la locomotion d’un ver et comprend un protocole d’échantillon pour mesurer la morphologie musculaire à l’aide d’un logicield’analysed’image.

Protocol

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Ce protocole est extrait de Teoh et coll., Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Quantification de la structure musculaire de la paroi corporelle

  1. Imagerie par fluorescence de la structure musculaire de la paroi corporelle
    1. Obtenir une souche (par exemple, RW1596) portant le transgène stEx30 (Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6 (su1006)), qui étiquette les fibres de myosine avec GFP.
      REMARQUE: L’introduction du transgène chez les animaux peut être obtenue soit en croisant une souche d’intérêt avec les animaux qui expriment déjà le transgène, soit en microinjectant l’ADN dans le bras distal de la 9ine. Le phénotype « roulant » induit par la mutation rol-6 dans ce transgène facilite la visualisation des muscles. Les muscles de la paroi du corps courent le long des côtés dorsal et ventral qui sont normalement empêchés de voir chez les animaux de type sauvage parce qu’ils se trouvent généralement sur l’un de leurs côtés latéraux. L’allèle rol-6(su1006) induit la torsion des animaux, exposant ainsi certaines cellules musculaires pour l’imagerie.
    2. Imagez les animaux à l’aide d’un microscope à fluorescence couplé à un appareil couplé à haute résolution chargé (CCD), objectif 40X ou plus, filtre GFP et logiciel d’acquisition.
    3. Ajustez le temps d’exposition et l’intensité de l’éclairage pour éviter les images sursaturées.
    4. Capturez et enregistrez des images de muscles (grossissement 400X) à partir d’une section de l’animal contenant au moins une cellule musculaire oblique visible complète. Évitez les régions avec une seule cellule musculaire qui est incomplète ou les sections qui sont hors de discussion. Exclure également les images des régions antérieures et postérieures extrêmes, et les régions adjacentes à la vulve.
      REMARQUE: Si l’animal n’a pas une seule cellule musculaire complète visible, faites glisser doucement le coverslip pour tourner l’animal afin d’exposer une cellule complète.
  2. Mesure de la zone des cellules musculaires
    1. Ouvrez l’image dans le logiciel Fidji (la version 2.0.0 a été utilisée dans cette étude).
    2. Utilisez la sélection de polygones pour tracer soigneusement autour d’une seule cellule musculaire oblique. Ajustez la ligne du polygone à l’extrémité en faisant glisser le point d’ancrage pour améliorer le traçage.
    3. Allez analyser l’onglet en haut du logiciel et cliquez sur Mesurer pour calculer la zone de la sélection. Un tableau de résultats distinct contenant la zone et d’autres mesures seront affichés. Si la mesure de zone est absente de la table des résultats, rendez-vous sur définir les mesures sous l’onglet Analyser et cochez que la case zone est cochée. De même, untick d’autres mesures qui ne sont pas nécessaires.
    4. Pour les cellules musculaires ayant une région dégénérée/manquante, tracez la région manquante avec l’outil de sélection du polygone et cliquez à nouveau sur Mesurer. S’il y a plusieurs lacunes à l’intérieur de la cellule, tracez chaque espace séparément.
    5. Calculer le rapport entre la zone d’écart et l’ensemble de la cellule musculaire. Un rapport élevé indique une plus grande étendue de dégénérescence musculaire due à de grandes lacunes au sein de la cellule. S’il n’y a pas de régions manquantes, comme on le voit couramment chez les animaux de type sauvage, le ratio serait calculé comme zéro.
      REMARQUE: En tant que contrôle, marquer également pour les défauts de structure musculaire visuellement et comparer les résultats avec la mesure quantitative. Ceci est particulièrement utile si la souche est étudiée pour la première fois en laboratoire. Pour la notation phénotypique, évaluez les animaux comme défectueux ou non défectueux en fonction de l’intégrité des filaments. Par exemple, les animaux qui ont perdu des striations distinctes de filament, des agglutinations de GFP ou des lacunes dans les cellules musculaires en raison d’une dégradation structurale seraient notés comme défectueux.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscope Leica TCS SP8 Inverted platform
Fluorescence microscope Carl Zeiss AG Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1 Thermo scientifique MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5 Zeiss 474030-9000-000 Made by SCHOTT
Glass slides Thermo scientifique MENS41104A/40

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