제브라피쉬 뇌 해부: 물고기 신경생물학 기술

Overview

이 비디오는 성인 얼룩말 물고기에서 뇌의 미세 절제의 기술을 설명합니다. 이 방법은 더 공부할 수 있는 전체 두뇌 유래 neuorospheres를 얻기에 도움이 됩니다.

Protocol

1. 성인 얼룩말 물고기 뇌의 해부

1. 젤 아이스 팩100mm x 15mm 페트리 접시를 채우고 해부 침대를 준비합니다. 그런 다음 뚜껑을 페트리 접시에 놓고 젤이 얼어 붙을 때까지 -20 °C에서 배양합니다. 뚜껑 위에 깨끗한 필터 용지 사각형을 놓고 필터 용지와 페트리 접시를 플라스틱 필름으로 포장합니다.
2. 모든 미세 절 악기를 70% 에탄올 또는 열로 청소하고 살균하여 각 사용 전에 사용할 수 있습니다. 모든 멸균 된 해부 기구를 해부 현미경 근처에 놓고 안락사 직전에 광섬유 조명이있는 현미경 아래에 해부 침대를 놓습니다.
3. 전체 뇌 신경권 준비를 위해 성인 얼룩말 물고기 2 마리를 수집하십시오. 및 해부 된 뇌 영역에서 신경 구를 생성 하는 3 ~ 4 얼룩말 물고기.
4. 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인 한 프로토콜을 사용하여 성인 얼룩말 물고기 (8-12 개월)를 안락사시. 다음으로, 물고기를 75% 에탄올에 5-10초 간 담그고 해부 침대에 빠르게 놓고 수술용 블레이드를 사용하여 아가미 의 수준에서 참수합니다.
   1. 동물을 안락사시키기 위해, 동물의 심장 박동이 점차 느려지고 순환이 멈출 때까지 트리카인 메탄술포네이트의 과다 복용 (300 mg /L)을 투여 한 다음 아이스 워터에 담가 두십시오.
5. 머리 등쪽을 아래로 돌리고 가위를 사용하여 절단 측에서 입으로 세로 컷을 만듭니다. 집게를 사용하여 두개골의 기저부가 노출되고 인접한 모든 조직을 제거합니다. 척수의 시작 부분에서 두개골의 측면 벽을 두개골쪽으로 잘라냅니다.
6. 가위를 사용하여 시신경을 잘라낸 다음 두개골 의 가장 측면 부분의 양쪽을 텍텀 수준에서 제거합니다. 머리 복부 쪽을 위로 돌립니다. 집게를 사용하여 두개골의 나머지 부분을 벗겨냅니다.
7. 해부 매체(페니실린/연쇄상구균)를 가진 DMEM/F12와 함께 두개골의 나머지 부분과 함께 뇌를 새로운 접시로 옮길 수 있습니다. 마이크로 칼의 플라스틱 손잡이를 사용하여 해부 매체의 뇌 조직을 청소하여 모든 뇌 구조를 그대로 유지합니다.
8. 이 시점에서, 전체 제브라피시 뇌를 사용하여 프로토콜을 계속.
   1. 또는 전체 얼룩말 피시 뇌또는 텔렌스팔론, tectum/diencephalon 또는 신선한 메스로 해부된 소뇌에서 신경구를 생성하기 위하여 특정 두뇌 지구에 이 프로토콜을 조정합니다. 도 1에 따라 관심 있는 뇌 영역을 해부하기 위해 신경 특이적 형광 제브라피시 신경 형질신경 형질 신경 형질대사를 사용한다.

Representative Results

그림 1: 제브라피쉬 뇌 유래 신경권의 차별화. (A-C, E) 1(A,DiVd1), 3(B,DiVd3) 및 4(C 및 D,DiVd4) 일 동안 Z 분화 배지에서 배양 된 전체 뇌 유래 신경구의 위상 대비 이미지. (E)12개월 된 Tg(GFAP:DsRed) 제브라피쉬의 뇌 전체의 등쪽 보기. 텔렌스팔론(Tel), 텍텀(Tec) 및 소뇌(Cer)는 도시된 바와 같이 해부되고 수집되었다. (D)통로 0(P0), 1(P1) 및 2(P2)에서 텍텀, 텔렌세팔론 및 소뇌에서 유래한 DiVd4 신경권의 이미지. 스케일 바: 25 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml