Zebrafish Brain Disissection: Een techniek van vis neurobiologie

Overview

Deze video beschrijft de techniek van microdissection van de hersenen van een volwassen zebravis. Deze methode helpt bij het verkrijgen van hele hersenen afgeleide neuorospheres die verder kunnen worden bestudeerd.

Protocol

1. Dissectie van het volwassen zebravisbrein

1. Bereid een dissectiebed voor door een petrischaal van 100 mm x 15 mm te vullen met gelijsverpakkingen. Plaats vervolgens het deksel op de petrischaal en incubeer bij -20 °C totdat de gel bevriest. Plaats bovenop het deksel een vierkant schoon filterpapier en wikkel zowel het filterpapier als de petrischaal in plastic folie.
2. Reinig en steriliseer alle microdissectie-instrumenten met 70% ethanol of warmte voor elk gebruik. Plaats alle gesteriliseerde dissectie-instrumenten in de buurt van de ontledingsmicroscoop en plaats vlak voor euthanasie het dissectiebed onder de microscoop met optische vezelverlichting.
3. Verzamel 2 volwassen zebravissen voor een hele hersenneurosfeervoorbereiding; en 3 tot 4 zebravissen om neurosferen te genereren uit ontlede hersengebieden.
4. Euthanaseer volwassen zebravissen (8-12 maanden oud) met behulp van een protocol dat is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee. Dompel vervolgens de vis 5-10 sec onder in 75% ethanol en plaats ze snel in het dissectiebed, gevolgd door onthoofding ter hoogte van de kieuwen met behulp van een chirurgisch mes.
   1. Om dieren te euthanaseren, dient u een overdosis (300 mg/L) tricaïnemethaansulfaat toe te dienen totdat de hartslag van het dier geleidelijk vertraagt en de bloedsomloop stopt en vervolgens wordt ondergedompeld in ijswater.
5. Draai de dorsale kant van het hoofd naar beneden en maak met behulp van de schaar een longitudinale snede van de snijkant naar de mond. Gebruik de tang om de basis van de schedel bloot te leggen en al het aangrenzende weefsel te verwijderen. Snijd de zijwanden van de schedel vanaf het begin van het ruggenmerg naar het tectum.
6. Knip en verwijder met behulp van de schaar de oogzenuwen en verwijder vervolgens beide zijden van het meest laterale deel van de schedel ter hoogte van het tectum. Draai de hoofdventerale kant naar boven. Verwijder met behulp van een tang de rest van het meest apicale deel van de schedel.
7. Breng de hersenen samen met het resterende deel van de schedel over in een nieuw gerecht met het dissectiemedium (DMEM/F12 met Penicilline /Streptomycine). Reinig het hersenweefsel in het dissectiemedium met behulp van het plastic handvat van het micromes, waardoor alle hersenstructuren intact blijven.
8. Vanaf dit punt gaat u verder met het protocol met behulp van het hele zebravisbrein.
   1. U kunt dit protocol ook aanpassen aan specifieke hersengebieden om neurosferen te genereren uit hele zebravishersenen of uit het telencephalon, tectum/diencephalon of cerebellum ontleed met een verse scalpel. Gebruik een neurale specifieke fluorescerende zebravis neurale transgene lijn om het hersengebied van belang te ontleden volgens figuur 1.

Representative Results

Figuur 1: Differentiatie van zebravissen hersenen-afgeleide neurosferen. (A-C, E) Fasecontrastbeelden van hele hersen-afgeleide neurosferen gekweekt in het Z-differentiatiemedium gedurende 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) en 4 (C en D, DiVd4) dagen. (E) Dorsale weergave van het hele brein van een 12 maanden oude Tg (GFAP:DsRed) zebravis. Het telencephalon (Tel), tectum (Tec) en cerebellum (Cer) werden ontleed en verzameld zoals getoond. (D) Afbeeldingen van DiVd4 neurosferen afgeleid van het tectum, telencephalon en cerebellum bij Passage 0 (P0), 1 (P1) en 2 (P2). Schaalbalk: 25 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml