Zebra Balığı Beyin Diseksiyonu: Balık Nörobiyolojisi Tekniği

Overview

Bu video, yetişkin bir zebra balığından beynin mikro dezenfeksiyon tekniğini açıklar. Bu yöntem, daha fazla çalışılabilen tüm beyin türevi nötrosferlerin elde edilmesine yardımcı olur.

Protocol

1. Yetişkin Zebra Balığı Beyninin Diseksiyonu

1. 100 mm x 15 mm Petri kabını jel buz torbaları ile doldurarak bir diseksiyon yatağı hazırlayın. Daha sonra kapağı petri kabına yerleştirin ve jel donana kadar -20 °C'de kuluçkaya yatırın. Kapağın üzerine bir kare temiz filtre kağıdı yerleştirin ve hem filtre kağıdını hem de petri kabını plastik filmle sarın.
2. Her kullanımdan önce tüm mikrodiseksiyon aletlerini % 70 etanol veya ısı ile temizleyin ve sterilize edin. Tüm sterilize diseksiyon aletlerini diseksiyon mikroskoplarının yakınına yerleştirin ve ötanaziden hemen önce diseksiyon yatağını optik fiber aydınlatmalı mikroskop altına yerleştirin.
3. Bütün bir beyin nörosferi hazırlığı için 2 yetişkin zebra balığı toplayın; ve parçalanmış beyin bölgelerinden nörosfer üretmek için 3 ila 4 zebra balığı.
4. Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan bir protokol kullanarak yetişkin zebra balıklarını (8-12 aylık) ötenazi yaptırın. Daha sonra, balığı 5-10 saniye boyunca% 75 etanol içine daldırın ve hızlı bir şekilde diseksiyon yatağına yerleştirin ve ardından cerrahi bir bıçak kullanarak solungaçların seviyesinde kafa kesme.
   1. Hayvanları ötenazi yapmak için, hayvanın kalp atışı yavaşlayıncaya ve dolaşım durana kadar aşırı dozda (300 mg / L) trikain metansülfonat sürün, sonra buzlu suya daldırin.
5. Baş sırt tarafını aşağı çevirin ve makası kullanarak kesilmiş taraftan ağza uzunlamasına bir kesim yapın. Perlepleri kullanarak kafatasının tabanını açığa çıkarır ve tüm bitişik dokuyu çıkarır. Kafatasının yan duvarlarını omuriliğin başlangıcından tümtiğe doğru kesin.
6. Makası kullanarak optik sinirleri kesin ve çıkarın ve ardından kafatasının en yanal kısmının her iki tarafını da tectum seviyesinde çıkarın. Baş ventral tarafı yukarı çevirin. Tokaları kullanarak kafatasının en apikal kısmının geri kalanını soyun.
7. Kafatasının kalan kısmıyla birlikte beyni diseksiyon ortamı (Penisilin / Streptomisin ile DMEM / F12) ile yeni bir yemeğe aktarın. Mikro bıçağın plastik sapını kullanarak diseksiyon ortamındaki beyin dokusunu temizleyin ve tüm beyin yapılarını sağlam tutun.
8. Bu noktadan sonra, tüm zebra balığı beynini kullanarak protokole devam edin.
   1. Alternatif olarak, tüm zebra balığı beyninden veya taze bir neşterle parçalanmış teleensefalon, tectum / diencephalon veya beyincikten nörosfer üretmek için bu protokolü belirli beyin bölgelerine uyarlamak. Şekil 1'egöre ilgi çekici beyin bölgesini parçalamak için nöral spesifik bir floresan zebra balığı nöral transgenik çizgi kullanın.

Representative Results

Şekil 1: Zebra Balığı Beyin kaynaklı Nörosferlerin Farklılaşması. (A-C, E) 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) ve 4 (C ve D, DiVd4) gün boyunca Z-farklılaşma ortamında kültürlenen tüm beyin kaynaklı nörosferlerin faz kontrast görüntüleri. (E) 12 aylık bir Tg (GFAP:DsRed) zebra balığının tüm beyninin dorsal görünümü. Teleensefalon (Tel), tectum (Tec) ve beyincik (Cer) gösterildiği gibi parçalandı ve toplandı. (D) Pasaj 0 (P0), 1 (P1) ve 2'de (P2) tectum, telencephalon ve beyincikten elde edilen DiVd4 nörosferlerinin görüntüleri. Ölçek çubuğu: 25 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1x	Life Technologies	11330-032
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Tricaine MS-222	Sigma	A5040	stock solution of 4 mg/ml