zPDX-侵襲性解析:ゼブラフィッシュ胚異種移植片における転移性癌細胞の侵襲的挙動の研究

Overview

このビデオは、トランスジェニックゼブラフィッシュ胚の膜膜空間への乳癌細胞送達のためのマイクロインジェクション方法を説明する。インキュベーション後、蛍光顕微鏡で胚を可視化し、がん細胞の浸潤、播種、転移を観察します。

Protocol

1. 転移処理のイメージと分析

1. 広い先端のパスツールピペットで複数の麻酔を受けた胚を収集し、ポリスチレン皿のガラス底に移します。
2. 余分な水を取り除き、限られた量の卵水を保管してください。毛ループツールで胚を所定の位置に操作し、ガラスの上にカバーを置きます。
3. 水浸漬または長距離乾燥目的と組み合わせて反転共焦点顕微鏡を使用してください。目的の領域が可能な限り目的に近いように胚を配置します。
4. 麻酔後すぐにイメージングを行い、液体の蒸発による死亡リスクを低減します。
   1. EGFP標識血管系とmCherry標識腫瘍細胞からのシグナルを胚上の同じ位置にキャプチャし、2つのイメージングチャネルを合体させることで注入された細胞を血管に共同登録する。
   2. ゼブラフィッシュの胚ごとに、ヘッド領域と尾部から2つの異なる画像セットを収集します。
5. 分布した細胞の数を定量化します。
   1. ペリビテリン空間注射の場合、頭と尾部の内の胚性魚の体に向かって細胞塊から広がった各魚の細胞の数を数える 4,15;領域は心臓腔の境界を越えて、下向きに泳ぐ膀胱の上にあり、尿生殖器の開口部を越えて大きく向かっている。
   2. Doc注射では、尾骨のコラーゲン線維を循環から浸出させた個々の細胞の数(MDA-MB-231)または各ゼブラフィッシュ19の尾骨造形組織(CHT)中の細胞(M2)によって形成されたクラスターの数を数える。
6. 共焦点顕微鏡法を用いて、浸潤と転移をより詳細に研究する(強く推奨)。
   1. 低倍率(4X目的)を使用して全身を画像化し、腫瘍細胞播種パターンの概観を得る。
      注:高倍率(20Xおよび40X目標)は、腫瘍内および腫瘍内血管新生の研究および胚体内での播種細胞の正確な局在化に適している。
   2. 488 nmレーザーを使用してゼブラフィッシュ胚脈管をスキャンし、543 nmレーザーで赤い蛍光を標識した埋め込み腫瘍細胞をスキャンします。各胚を8~10ステップでスキャンして、高品質の画像を得ます。スキャンし、各ステップを6回平均します。
7. さらなる実験に必要な場合は、慎重に胚を卵水に戻します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL)	Eppendorf	F276456I
Confocal microscope	Leica	SP5 STED
Stereo microscope	Leica	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain			Kindly provided by Dr. Ewa SnaarJagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Polystyrene dish with glass bottom	WillCo	GWST-5040
Fluorescent stereo microscope	Leica	M165 FC
Tricaine (3-aminobenzoic acid)	SigmaAldrich	A-5040