zPDX-침습성 분석: 제브라피시 배아 이종이식편에서 전이성 암세포의 침습적 행동 조사

Abstract

출처: Ren, J. et al. 배아 제브라피쉬에서 인간 유방암 세포의 침습적 행동. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 형질전환 제브라피시 배아의 주위 공간으로 유방암 세포를 전달하는 미세주입 방법을 설명합니다. 배양 후, 형광 현미경으로 배아를 시각화하여 암세포의 침입, 전파 및 전이를 관찰합니다.

Protocol

1. 전이 과정 이미지 및 분석

1. 끝이 넓은 파스퇴르 피펫으로 마취된 배아 여러 개를 모아 폴리스티렌 접시의 유리 바닥으로 옮깁니다.
2. 과도한 물을 제거하고 제한된 양의 계란 물을 보관하십시오. 헤어 루프 도구를 사용하여 배아를 제자리로 조작하고 유리 위에 덮개를 놓습니다.
3. 도립 컨포칼 현미경을 침수 또는 장거리 건식 대물렌즈와 함께 사용하십시오. 관심 영역이 목표에 최대한 가깝도록 배아를 배치합니다.
4. 마취 직후 이미징을 수행하여 액체 증발로 인한 사망 위험을 줄입니다.
   1. 배아의 동일한 위치에 있는 EGFP 표지 혈관 구조 및 mCherry 표지 종양 세포의 신호를 캡처하여 두 이미징 채널을 병합하여 주입된 세포를 혈관과 함께 등록합니다.
   2. 각 제브라피시 배아에 대해 머리 영역과 꼬리 영역에서 두 개의 서로 다른 이미지 세트를 수집합니다.
5. 파종된 세포의 수를 정량화합니다.
   1. perivitelline 공간 주사의 경우, 머리 및 꼬리 영역 내의 배아 물고기 몸체로 세포 덩어리에서 퍼진 각 물고기의 세포 수를 계산합니다 4,15; 영역은 정면으로 심장 구멍의 경계를 넘어서고, 등쪽으로는 부레의 위쪽에, 꼬리 쪽으로는 비뇨 생식기 개구부 너머에 있습니다.
   2. Doc 주사의 경우, 순환을 통해 꼬리지느러미의 콜라겐 섬유에 침입한 개별 세포의 수(MDA-MB-231) 또는 각 제브라피시의 꼬리 조혈 조직(CHT)에서 세포가 집합적으로 형성한 클러스터(M2)의 수를 계산합니다19.
6. 컨포칼 현미경을 사용하여 침습 및 전이를 더 자세히 연구합니다(적극 권장).
   1. 저배율(4X 대물렌즈)을 사용하여 전신을 이미지화하고 종양 세포 전파 패턴의 개요를 얻을 수 있습니다.
      참고: 더 높은 배율(20X 및 40X 대물렌즈)은 종양 내 및 종양 주위 혈관 신생과 배아체에서 파종된 세포의 정확한 국소화를 연구하는 데 적합합니다.
   2. 488nm 레이저를 사용하여 제브라피시 배아 혈관 구조를 스캔하고 543nm 레이저를 사용하여 적색 형광으로 표지된 이식된 종양 세포를 스캔합니다. 8-10단계로 각 배아를 스캔하여 고품질 이미지를 얻을 수 있습니다. 각 단계를 6번 스캔하고 평균을 냅니다.
7. 추가 실험에 필요한 경우 배아를 난자 물에 조심스럽게 다시 넣으십시오.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
와이드 팁 파스퇴르 피펫 (0.5-20 μL)	에펜도르프	F276456I
컨포칼 현미경	라이카	SP5 표준
실체 현미경	라이카	MZ16FA
Tg (fli : EGFP) 제브라 피쉬 균주			Ewa SnaarJagalska 박사(네덜란드 라이덴 라이덴 대학교 생물학 연구소)가 친절하게 제공했습니다.
유리 바닥이 있는 폴리스티렌 접시	윌코	GWST-5040
형광 실체 현미경	라이카	M165 FC
트리카인(3-아미노벤조산)	시그마알드리치	A-5040