Overview
이 비디오는 형질전환 제브라피시 배아의 각막 공간으로 유방암 세포 전달을 위한 미세 주입 방법을 설명합니다. 잠복 후, 우리는 암 세포 침략, 보급 및 전이를 관찰하기 위해 형광 현미경으로 배아를 시각화합니다.
Protocol
1. 전이성 프로세스를 이미지 및 분석
- 넓은 팁 파스퇴르 파이펫으로 여러 마취 배아를 수집하고 폴리스티렌 접시의 유리 바닥으로 옮길 수 있습니다.
- 여분의 물을 제거하고 계란 물의 제한된 양을 유지합니다. 헤어 루프 도구로 배아를 제자리에 조작하고 유리 위에 덮개를 놓습니다.
- 물에 담그거나 장거리 건조 목표와 함께 반전된 공초점 현미경을 사용하십시오. 관심 영역이 가능한 한 목표에 가깝게 지정합니다.
- 마취 직후에 이미징을 수행하여 액체 증발로 인한 사망 위험을 줄입니다.
- EGFP 표지된 혈관과 mCherry 표지종양 세포로부터 신호를 배아에 동일한 위치에 포착하여 두 개의 이미징 채널을 병합하여 혈관으로 주입된 세포를 공동 등록합니다.
- 각 제브라피시 배아에 대해 머리 부위와 꼬리 부위에서 두 개의 서로 다른 이미지 세트를 수집합니다.
- 보급된 세포의 수를 정량화합니다.
- 인식 공간 주사를 위해, 머리와 꼬리 영역 내의 배아 물고기 체를 향해 세포 질량에서 전파된 각 물고기의 세포 수를 4,15; 이 지역은 앞쪽으로 심장 캐비티의 경계를 넘어, 수영 방광 의 상단에, 그리고 비뇨 생식기 개개 를 넘어.
- Doc 주입의 경우, 각 zebrafish19의 소달 조혈 조직(CHT)에서 테일핀의 콜라겐 섬유를 순환(MDA-MB-231) 또는 세포에 의해 집합적으로 형성된 클러스터의 수를 계산한다.
- 공초점 현미경 검사법을 사용하여 더 자세하게 침략과 전이를 연구하십시오 (매우 권장).
- 낮은 배율(4X 목표)을 사용하여 전신을 이미지화하고 종양 세포 보급 패턴에 대한 개요를 얻을 수 있습니다.
참고: 배율(20X 및 40X 목표)은 배아 체내 의 내 및 회리 종양 혈관 신생 및 정확한 국소화를 연구하는 데 적합합니다. - 488nm 레이저를 사용하여 제브라피시 배아 혈관과 543 nm 레이저를 사용하여 적색 형광으로 표시된 이식된 종양 세포를 스캔합니다. 각 배아를 8~10단계로 스캔하여 고품질 의 이미지를 얻을 수 있습니다. 스캔하고 각 단계의 평균 6 회.
- 낮은 배율(4X 목표)을 사용하여 전신을 이미지화하고 종양 세포 보급 패턴에 대한 개요를 얻을 수 있습니다.
- 추가 실험에 필요한 경우 배아를 달걀 물에 조심스럽게 다시 넣습니다.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL) | Eppendorf | F276456I | |
Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa SnaarJagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 | |
Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 |