zPDX-تحليل التوغل: التحقيق في السلوك الغازي للخلايا السرطانية النقيلي في زيبرافيش الجنين Xenografts

Overview

يصف هذا الفيديو طريقة حقن دقيق لتوصيل خلايا سرطان الثدي إلى الفضاء perivitelline من أجنة حمار وحشي المعدلة وراثيا. بعد الحضانة ، ونحن تصور الجنين تحت المجهر الفلورسنت لمراقبة غزو الخلايا السرطانية ، ونشر ، والانبثاث.

Protocol

1. صورة وتحليل عملية النقيلي

1. جمع العديد من الأجنة تخدير مع ماصة باستور واسعة تلميح ونقلها إلى الجزء السفلي الزجاجي من طبق البوليسترين.
2. إزالة المياه الزائدة والحفاظ على كمية محدودة من ماء البيض. التعامل مع الجنين في موقف مع أداة حلقة الشعر ووضع غطاء على رأس الزجاج.
3. استخدام المجهر الكونفوجكال مقلوب في تركيبة مع المياه الغمر أو أهداف جافة لمسافات طويلة. ضع الجنين بحيث تكون منطقة الاهتمام قريبة من الهدف قدر الإمكان.
4. إجراء التصوير مباشرة بعد التخدير للحد من خطر الوفاة بسبب التبخر السائل.
   1. التقاط إشارات من الأوعية الدموية المسماة EGFP والخلايا السرطانية المسماة mCherry في نفس الموقف على الأجنة للتسجيل المشترك للخلايا المحقونة مع الأوعية الدموية عن طريق دمج قناتي التصوير.
   2. لكل جنين حمار وحشي، جمع مجموعتين مختلفتين من الصور من منطقة الرأس ومنطقة الذيل.
5. تحديد عدد الخلايا المنشورة.
   1. بالنسبة لحقن الفضاء البريفيتيليني، عد عدد الخلايا في كل سمكة التي تم نشرها من كتلة الخلية نحو جسم السمك الجنيني داخل مناطق الرأس والذيل 4,15؛ المناطق هي خارج حدود تجويف القلب أماميا، على رأس المثانة السباحة ظهريا، وخارج فتح البولي التناسلي caudally.
   2. لحقن الوثيقة، عد عدد الخلايا الفردية التي غزت ألياف الكولاجين من tailfin من الدورة الدموية (MDA-MB-231) أو عدد المجموعات التي شكلتها الخلايا بشكل جماعي (M2) في الأنسجة الدموية الكادوية (CHT) من كل حمار وحشي19.
6. دراسة الغزو والانبثاث بمزيد من التفصيل باستخدام المجهر confocal (موصى به للغاية).
   1. استخدام التكبير منخفضة (الهدف 4X) لتصوير الجسم كله والحصول على لمحة عامة عن نمط نشر الخلايا السرطانية.
      ملاحظة: التكبير العالي (أهداف 20X و 40X) مناسب لدراسة تولد الأوعية داخل الورم وحوله والتوطين الدقيق للخلايا المنشورة في جسم الجنين.
   2. استخدام ليزر 488 نانومتر لمسح الأوعية الجنين حمار وحشي والليزر 543 نانومتر لمسح الخلايا السرطانية المزروعة المسمى مع مضان أحمر. الحصول على صورة عالية الجودة عن طريق مسح كل جنين في ثماني إلى عشر خطوات. مسح متوسط كل خطوة ست مرات.
7. ضع الجنين بعناية مرة أخرى في ماء البويضة إذا كان مطلوبا لإجراء المزيد من التجارب.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL)	Eppendorf	F276456I
Confocal microscope	Leica	SP5 STED
Stereo microscope	Leica	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain			Kindly provided by Dr. Ewa SnaarJagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Polystyrene dish with glass bottom	WillCo	GWST-5040
Fluorescent stereo microscope	Leica	M165 FC
Tricaine (3-aminobenzoic acid)	SigmaAldrich	A-5040