zPDX-आक्रामकता का विश्लेषण: जेब्राफिश भ्रूण Xenografts में मेटास्टेटिक कैंसर कोशिकाओं के आक्रामक व्यवहार की जांच

Overview

यह वीडियो ट्रांसजेनिक जेब्राफिश भ्रूण के पेरिविटेललाइन स्पेस में ब्रेस्ट कैंसर सेल डिलिवरी के लिए माइक्रोइंजेक्शन मेथड का वर्णन करता है । इनक्यूबेशन के बाद, हम कैंसर सेल आक्रमण, प्रसार और मेटास्टेसिस का निरीक्षण करने के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण की कल्पना करते हैं।

Protocol

1. मेटास्टेटिक प्रक्रिया की छवि और विश्लेषण करें

1. एक विस्तृत टिप पाश्चर पिपेट के साथ कई एनेस्थेटाइज्ड भ्रूण ले लीजिए और उन्हें पॉलीस्टीरिन डिश के ग्लास बॉटम में स्थानांतरित करें।
2. अतिरिक्त पानी निकालें और सीमित मात्रा में अंडे का पानी रखें। एक बाल पाश उपकरण के साथ स्थिति में भ्रूण में हेरफेर और गिलास के शीर्ष पर एक कवर जगह है ।
3. पानी के विसर्जन या लंबी दूरी के शुष्क उद्देश्यों के साथ संयोजन में एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। भ्रूण को ऐसी स्थिति दें कि ब्याज का क्षेत्र यथासंभव उद्देश्य के करीब हो ।
4. तरल वाष्पीकरण के कारण मौत के जोखिम को कम करने के लिए संज्ञाहरण के तुरंत बाद इमेजिंग करें।
   1. दो इमेजिंग चैनलों को मिलाकर रक्त वाहिकाओं के साथ इंजेक्शन कोशिकाओं को सह-पंजीकृत करने के लिए भ्रूण पर एक ही स्थिति में EGFP-लेबल वाले वाक्यूलेचर और एमसीएचरी-लेबल ट्यूमर कोशिकाओं से संकेतों को कैप्चर करें।
   2. प्रत्येक जेब्राफिश भ्रूण के लिए, सिर क्षेत्र और पूंछ क्षेत्र से छवियों के दो अलग-अलग सेट एकत्र करें।
5. प्रसारित कोशिकाओं की संख्या की मात्रा निर्धारित करें।
   1. पेरिविटेललाइन अंतरिक्ष इंजेक्शन के लिए, प्रत्येक मछली में कोशिकाओं की संख्या की गणना करें जो कोशिका द्रव्यमान से सिर और पूंछ क्षेत्रों के भीतर भ्रूणीय मछली शरीर की ओर प्रसारित किए गए हैं 4,15; क्षेत्र दिल गुहा की सीमाओं से परे हैं, तैरने वाले मूत्राशय के शीर्ष पर, और यूरोजेनिटल खोलने से परे हैं।
   2. डॉक्टर इंजेक्शन के लिए, प्रत्येक जेब्राफिश 19 के कौडल हेमेटोपोइटिक ऊतक (सीएचटी) में सामूहिक रूप से कोशिकाओं द्वारा गठित कोशिकाओं द्वारा गठित समूहों की संख्या (एमडीए-एमबी-231) से टेलफिन के कोलेजन फाइबर पर हमला करने वाली व्यक्तिगत कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
6. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (अत्यधिक अनुशंसित) का उपयोग करके अधिक विस्तार से आक्रमण और मेटास्टेसिस का अध्ययन करें।
   1. पूरे शरीर की छवि और ट्यूमर सेल प्रसार पैटर्न का अवलोकन प्राप्त करने के लिए कम आवर्धन (4X उद्देश्य) का उपयोग करें।
      नोट: उच्च आवर्धन (20X और 40X उद्देश्य) इंट्रा-और पेरी-ट्यूमर एंजियोजेनेसिस और भ्रूण शरीर में प्रसारित कोशिकाओं के सटीक स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है।
   2. एक 488 एनएम लेजर का प्रयोग करने के लिए जेब्राफिश भ्रूण vasculature स्कैन और लाल फ्लोरेसेंस के साथ लेबल प्रत्यारोपित ट्यूमर कोशिकाओं को स्कैन करने के लिए एक 543 एनएम लेजर। आठ से दस चरणों में प्रत्येक भ्रूण को स्कैन करके एक उच्च गुणवत्ता वाली छवि प्राप्त करें। स्कैन और औसत प्रत्येक कदम छह बार।
7. यदि आगे के प्रयोगों के लिए आवश्यक है तो ध्यान से भ्रूण को अंडे के पानी में वापस रखें।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL)	Eppendorf	F276456I
Confocal microscope	Leica	SP5 STED
Stereo microscope	Leica	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain			Kindly provided by Dr. Ewa SnaarJagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Polystyrene dish with glass bottom	WillCo	GWST-5040
Fluorescent stereo microscope	Leica	M165 FC
Tricaine (3-aminobenzoic acid)	SigmaAldrich	A-5040