zPDX-침략성 분석: 얼룩말 피시 태아 제노이식에 있는 전이성 암세포의 침략적인 행동을 조사합니다

Overview

이 비디오는 형질전환 제브라피시 배아의 각막 공간으로 유방암 세포 전달을 위한 미세 주입 방법을 설명합니다. 잠복 후, 우리는 암 세포 침략, 보급 및 전이를 관찰하기 위해 형광 현미경으로 배아를 시각화합니다.

Protocol

1. 전이성 프로세스를 이미지 및 분석

1. 넓은 팁 파스퇴르 파이펫으로 여러 마취 배아를 수집하고 폴리스티렌 접시의 유리 바닥으로 옮길 수 있습니다.
2. 여분의 물을 제거하고 계란 물의 제한된 양을 유지합니다. 헤어 루프 도구로 배아를 제자리에 조작하고 유리 위에 덮개를 놓습니다.
3. 물에 담그거나 장거리 건조 목표와 함께 반전된 공초점 현미경을 사용하십시오. 관심 영역이 가능한 한 목표에 가깝게 지정합니다.
4. 마취 직후에 이미징을 수행하여 액체 증발로 인한 사망 위험을 줄입니다.
   1. EGFP 표지된 혈관과 mCherry 표지종양 세포로부터 신호를 배아에 동일한 위치에 포착하여 두 개의 이미징 채널을 병합하여 혈관으로 주입된 세포를 공동 등록합니다.
   2. 각 제브라피시 배아에 대해 머리 부위와 꼬리 부위에서 두 개의 서로 다른 이미지 세트를 수집합니다.
5. 보급된 세포의 수를 정량화합니다.
   1. 인식 공간 주사를 위해, 머리와 꼬리 영역 내의 배아 물고기 체를 향해 세포 질량에서 전파된 각 물고기의 세포 수를 4,15; 이 지역은 앞쪽으로 심장 캐비티의 경계를 넘어, 수영 방광 의 상단에, 그리고 비뇨 생식기 개개 를 넘어.
   2. Doc 주입의 경우, 각 zebrafish19의 소달 조혈 조직(CHT)에서 테일핀의 콜라겐 섬유를 순환(MDA-MB-231) 또는 세포에 의해 집합적으로 형성된 클러스터의 수를 계산한다.
6. 공초점 현미경 검사법을 사용하여 더 자세하게 침략과 전이를 연구하십시오 (매우 권장).
   1. 낮은 배율(4X 목표)을 사용하여 전신을 이미지화하고 종양 세포 보급 패턴에 대한 개요를 얻을 수 있습니다.
      참고: 배율(20X 및 40X 목표)은 배아 체내 의 내 및 회리 종양 혈관 신생 및 정확한 국소화를 연구하는 데 적합합니다.
   2. 488nm 레이저를 사용하여 제브라피시 배아 혈관과 543 nm 레이저를 사용하여 적색 형광으로 표시된 이식된 종양 세포를 스캔합니다. 각 배아를 8~10단계로 스캔하여 고품질 의 이미지를 얻을 수 있습니다. 스캔하고 각 단계의 평균 6 회.
7. 추가 실험에 필요한 경우 배아를 달걀 물에 조심스럽게 다시 넣습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL)	Eppendorf	F276456I
Confocal microscope	Leica	SP5 STED
Stereo microscope	Leica	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain			Kindly provided by Dr. Ewa SnaarJagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Polystyrene dish with glass bottom	WillCo	GWST-5040
Fluorescent stereo microscope	Leica	M165 FC
Tricaine (3-aminobenzoic acid)	SigmaAldrich	A-5040