zPDX-Анализ инвазивности: Исследование инвазивного поведения метастатических раковых клеток в ксенотрансплантатах эмбрионов зебры

Overview

Это видео описывает метод микроинъекции для доставки раковых клеток молочной железы в перивителлин пространство трансгенных эмбрионов зебры. После инкубации мы визуализируем эмбрион под флуоресцентным микроскопом, чтобы наблюдать вторжение раковых клеток, распространение и метастазы.

Protocol

1. Изображение и анализ метастатического процесса

1. Соберите несколько анестезированные эмбрионы с широкой наконечником пастер пипетки и передать их на стеклянное дно полистирола блюдо.
2. Удалите излишки воды и держать ограниченное количество яичной воды. Манипулируйте эмбрионом в положение с помощью инструмента петли волос и поместите крышку поверх стекла.
3. Используйте перевернутый конфокальный микроскоп в сочетании с погружением в воду или сухими целями на большие расстояния. Распоить эмбрион таким образом, чтобы область интересов была как можно ближе к цели.
4. Выполняем визуализацию сразу после анестезии, чтобы снизить риск смерти от испарения жидкости.
   1. Захват сигналов от EGFP помечены сосудов и mCherry помечены опухолевые клетки в том же положении на эмбрионах для совместной регистрации инъекционных клеток с кровеносными сосудами путем слияния двух каналов визуализации.
   2. Для каждого эмбриона зебры, собрать два различных набора изображений из области головы и хвоста области.
5. Количественная оценка количества распространяемых ячеек.
   1. Для перивителлиновых космических инъекций подсчитайте количество клеток в каждой рыбе, которые распространились из клеточной массы в эмбриональное тело рыбы в области головы и хвоста 4,15; области находятся за пределами полости сердца фронтально, на вершине плавательного пузыря dorsally, и за урогенитального открытия caudally.
   2. Для инъекции Doc подсчитайте количество отдельных клеток, которые вторглись в коллагеновые волокна хвостового плавника из циркуляции (MDA-MB-231) или количество скоплений, образованных клетками коллективно (M2) в хвостовой гематопоэтических тканях (CHT) каждой зебры19.
6. Изучение вторжения и метастазов более подробно с помощью конфокальные микроскопии (настоятельно рекомендуется).
   1. Используйте низкое увеличение (4X цель) для изображения всего тела и получить обзор структуры распространения опухолевых клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокое увеличение (20X и 40X целей) подходит для изучения внутри- и пери-опухолевого ангиогенеза и точной локализации рассеянных клеток в организме эмбриона.
   2. Используйте лазер 488 нм для сканирования сосудов эмбриона зебры и лазер 543 нм для сканирования имплантированных опухолевых клеток, помеченных красной флуоресценцией. Получите высококачественное изображение, сканируя каждый эмбрион в восемь-десять шагов. Сканирование и среднее каждый шаг шесть раз.
7. Тщательно поместите эмбрион обратно в яичную воду, если это необходимо для дальнейших экспериментов.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL)	Eppendorf	F276456I
Confocal microscope	Leica	SP5 STED
Stereo microscope	Leica	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain			Kindly provided by Dr. Ewa SnaarJagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Polystyrene dish with glass bottom	WillCo	GWST-5040
Fluorescent stereo microscope	Leica	M165 FC
Tricaine (3-aminobenzoic acid)	SigmaAldrich	A-5040