zPDX-Analisi dell'invasività: studio del comportamento invasivo delle cellule tumorali metastatiche negli xenografti embrionali Zebrafish

Overview

Questo video descrive un metodo di microiniezione per la somministrazione di cellule tumorali al seno nello spazio perivitellino degli embrioni transgenici di zebrafish. Dopo l'incubazione, visualizziamo l'embrione al microscopio fluorescente per osservare l'invasione, la diffusione e la metastasi delle cellule tumorali.

Protocol

1. Immagine e analisi del processo metastatico

1. Raccogli diversi embrioni anestetizzati con una pipetta Pasteur a punta larga e trasferiscili sul fondo di vetro di un piatto di polistirolo.
2. Rimuovere l'acqua in eccesso e mantenere una quantità limitata di acqua d'uovo. Manipolare l'embrione in posizione con uno strumento ad anello per capelli e posizionare una copertura sopra il vetro.
3. Utilizzare un microscopio confocale invertito in combinazione con obiettivi ad immersione in acqua o a secco a lunga distanza. Posizionare l'embrione in modo che la regione di interesse sia il più vicino possibile all'obiettivo.
4. Eseguire l'imaging immediatamente dopo l'anestesia per ridurre il rischio di morte dovuto all'evaporazione liquida.
   1. Cattura i segnali da cellule tumorali etichettate EGFP e mCherry nella stessa posizione sugli embrioni per co-registrare le cellule iniettate con vasi sanguigni fondendo i due canali di imaging.
   2. Per ogni embrione zebrafish, raccogli due diversi set di immagini dalla regione della testa e dalla regione della coda.
5. Quantificare il numero di cellule diffuse.
   1. Per le iniezioni spaziali perivitelline, contare il numero di cellule in ogni pesce che si sono diffuse dalla massa cellulare verso il corpo embrionale del pesce all'interno delle regioni della testa e della coda 4,15; le regioni sono oltre i confini della cavità cardiaca frontalmente, in cima alla vescica di nuoto dorsalmente, e oltre l'apertura urogenitale caudally.
   2. Per l'iniezione Doc, contare il numero di singole cellule che hanno invaso le fibre di collagene della pinna posteriore dalla circolazione (MDA-MB-231) o il numero di ammassi formati dalle cellule collettivamente (M2) nel tessuto ematopoietico caudale (CHT) di ogni zebrafish19.
6. Studia l'invasione e la metastasi in modo più dettagliato utilizzando la microscopia confocale (altamente raccomandata).
   1. Utilizzare un basso ingrandimento (obiettivo 4X) per immaginere tutto il corpo e ottenere una panoramica del modello di diffusione delle cellule tumorali.
      NOTA: Un ingrandimento più elevato (obiettivi 20X e 40X) è adatto per lo studio dell'angiogenesi intra e peri-tumorale e per la localizzazione precisa delle cellule diffuse nel corpo dell'embrione.
   2. Utilizzare un laser a 488 nm per scansionare la vascucolatura dell'embrione zebrafish e un laser a 543 nm per scansionare le cellule tumorali impiantate etichettate con fluorescenza rossa. Ottieni un'immagine di alta qualità scansionando ogni embrione in otto o dieci passaggi. Scansiona e media ogni passaggio sei volte.
7. Riposizionare con cura l'embrione nell'acqua dell'uovo se necessario per ulteriori esperimenti.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL)	Eppendorf	F276456I
Confocal microscope	Leica	SP5 STED
Stereo microscope	Leica	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain			Kindly provided by Dr. Ewa SnaarJagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Polystyrene dish with glass bottom	WillCo	GWST-5040
Fluorescent stereo microscope	Leica	M165 FC
Tricaine (3-aminobenzoic acid)	SigmaAldrich	A-5040