zPDX-analys av invasivitet: Undersöka invasivt beteende hos metastaserade cancerceller i zebrafiskembryon Xenografts

Overview

Denna video beskriver en mikroinjektion metod för bröstcancer cell leverans till perivitelline utrymme av transgena zebrafisk embryon. Efter inkubation visualiserar vi embryot under ett fluorescerande mikroskop för att observera cancercellsinvasion, spridning och metastasering.

Protocol

1. Avbilda och analysera den metastaserade processen

1. Samla flera bedövade embryon med en bred topp Pasteur pipett och överför dem till glasbotten på en polystyrenrätt.
2. Ta bort överflödigt vatten och behåll en begränsad mängd äggvatten. Manipulera embryot på plats med ett hårslingverktyg och placera ett lock ovanpå glaset.
3. Använd ett inverterat konfokalt mikroskop i kombination med vattensänkning eller långväga torra mål. Placera embryot så att intresseområdet ligger så nära målet som möjligt.
4. Utför avbildning omedelbart efter anestesi för att minska risken för dödsfall på grund av vätskeavdunstning.
   1. Fånga signaler från EGFP-märkt vaskulatur och mCherry-märkta tumörceller i samma position på embryona för att samregistrera injicerade celler med blodkärl genom att slå samman de två bildkanalerna.
   2. För varje zebrafiskembryon, samla två olika uppsättningar bilder från huvudregionen och svansregionen.
5. Kvantifiera antalet spridade celler.
   1. För perivitellinrymdinjektioner, räkna antalet celler i varje fisk som har spridits från cellmassan mot den embryonala fiskkroppen inom huvud- och svansregionerna 4,15; regionerna ligger utanför gränserna för hjärthålan frontalt, ovanpå simblåsan dorsally och bortom den urogenitala öppningen kaudally.
   2. För Doc-injektionen, räkna antalet enskilda celler som har invaderat kollagenfibrerna i tailfin från cirkulationen (MDA-MB-231) eller antalet kluster som bildas av celler kollektivt (M2) i kaudal hematopoetisk vävnad (CHT) av varje zebrafisk19.
6. Studieinvasion och metastasering mer detaljerat genom att använda konfokal mikroskopi (rekommenderas starkt).
   1. Använd låg förstoring (4X-mål) för att avbilda hela kroppen och för att få en översikt över tumörcellsspridningsmönstret.
      OBS: Högre förstoring (20X och 40X mål) är lämplig för att studera intra- och peri-tumoral angiogenes och den exakta lokaliseringen av spridade celler i embryokroppen.
   2. Använd en 488 nm laser för att skanna zebrafiskembryonvaskulaturen och en 543 nm laser för att skanna implanterade tumörceller märkta med röd fluorescens. Få en högkvalitativ bild genom att skanna varje embryo i åtta till tio steg. Skanna och i genomsnitt varje steg sex gånger.
7. Placera försiktigt embryot tillbaka i äggvattnet om det behövs för ytterligare experiment.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL)	Eppendorf	F276456I
Confocal microscope	Leica	SP5 STED
Stereo microscope	Leica	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain			Kindly provided by Dr. Ewa SnaarJagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Polystyrene dish with glass bottom	WillCo	GWST-5040
Fluorescent stereo microscope	Leica	M165 FC
Tricaine (3-aminobenzoic acid)	SigmaAldrich	A-5040