zPDX-analyse af invasivitet: Undersøgelse invasiv adfærd metastatiske kræftceller i zebrafisk Embryo Xenografts

Overview

Denne video beskriver en mikroinjection metode til brystkræft celle levering i perivitelline rummet af transgene zebrafisk embryoner. Efter inkubation visualiserer vi embryoet under et fluorescerende mikroskop for at observere kræftcelleinvasion, formidling og metastaser.

Protocol

1. Billede og analyser den metastatiske proces

1. Saml flere bedøvede embryoner med en bred spids Pasteur pipette og overfør dem til glasbunden af en polystyren skål.
2. Fjern overskydende vand og holde en begrænset mængde æg vand. Manipuler embryoet på plads med et hårsløjfeværktøj, og placer et dæksel oven på glasset.
3. Brug et omvendt konfokalt mikroskop i kombination med vand-nedsænkning eller langdistance tørre mål. Placer embryoet således, at interesseregionen er så tæt på målet som muligt.
4. Udfør billeddannelse umiddelbart efter anæstesi for at reducere risikoen for død på grund af væskefordampning.
   1. Indfang signaler fra EGFP-mærket vaskulatur og mCherry-mærkede tumorceller på samme position på embryonerne for at registrere injicerede celler med blodkar ved at fusionere de to billedkanaler.
   2. For hver zebrafiskembryo indsamles to forskellige sæt billeder fra hovedregionen og haleregionen.
5. Kvantificere antallet af formidlede celler.
   1. For perivitelline rum injektioner, tælle antallet af celler i hver fisk, der har formidlet fra cellemassen mod embryonale fisk kroppen i hoved og hale regioner 4,15; regionerne er uden for grænserne af hjertet hulrum frontalt, på toppen af svømmeblæren dorsally, og ud over urogenitalen åbning kaudalet.
   2. For Doc injektion, tælle antallet af individuelle celler, der har invaderet kollagen fibre af tailfin fra omsætning (MDA-MB-231) eller antallet af klynger dannet af celler kollektivt (M2) i kaudale hæmatopoietiske væv (CHT) af hver zebrafisk19.
6. Undersøgelse invasion og metastaser mere detaljeret ved hjælp af konfokal mikroskopi (stærkt anbefales).
   1. Brug lav forstørrelse (4X mål) til at billedet hele kroppen og for at få et overblik over tumor celle formidling mønster.
      BEMÆRK: Højere forstørrelse (20X og 40X mål) er velegnet til at studere intra- og peri-tumoral angiogenese og præcis lokalisering af formidlede celler i embryoet kroppen.
   2. Brug en 488 nm laser til at scanne zebrafisk embryo vaskulatur og en 543 nm laser til at scanne implanterede tumorceller mærket med rød fluorescens. Få et billede af høj kvalitet ved at scanne hvert foster i otte til ti trin. Scan og gennemsnit hvert trin seks gange.
7. Placer forsigtigt embryoet tilbage i ægget, hvis det er nødvendigt for yderligere forsøg.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL)	Eppendorf	F276456I
Confocal microscope	Leica	SP5 STED
Stereo microscope	Leica	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain			Kindly provided by Dr. Ewa SnaarJagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Polystyrene dish with glass bottom	WillCo	GWST-5040
Fluorescent stereo microscope	Leica	M165 FC
Tricaine (3-aminobenzoic acid)	SigmaAldrich	A-5040