zPDX-ניתוח של פולשנות: חקירת התנהגות פולשנית של תאים סרטניים גרורתיים ב Xenografts עובר זברה

Overview

וידאו זה מתאר שיטת microinjection עבור העברת תאים סרטן השד לתוך החלל perivitelline של עוברי זברה מהונדסים. לאחר הדגירה, אנו מדמיינים את העובר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לצפות בפלישה לתאי סרטן, הפצה וגרורות.

Protocol

1. תמונה וניתוח של תהליך גרורתי

1. לאסוף כמה עוברים מורדמים עם פיפטה פסטר רחב קצה ולהעביר אותם לתחתית הזכוכית של צלחת פוליסטירן.
2. הסר מים עודפים ולשמור כמות מוגבלת של מי ביצה. לתפעל את העובר למקומו עם כלי לולאת שיער ומניחים כיסוי על גבי הזכוכית.
3. השתמש במיקרוסקופ קונפוקל הפוך בשילוב עם טבילה במים או מטרות יבשות למרחקים ארוכים. מקם את העובר כך שאזור העניין קרוב ככל האפשר למטרה.
4. בצע הדמיה מיד לאחר הרדמה כדי להפחית את הסיכון למוות עקב אידוי נוזלי.
   1. ללכוד אותות מ EGFP שכותרתו vasculature ותאי גידול mCherry שכותרתו באותו מיקום על העוברים כדי להירשם יחד תאים מוזרקים עם כלי דם על ידי מיזוג שני ערוצי ההדמיה.
   2. עבור כל עובר זברה, לאסוף שתי קבוצות שונות של תמונות מאזור הראש ואזור הזנב.
5. כימת את מספר התאים המופצים.
   1. עבור זריקות חלל perivitelline, לספור את מספר התאים בכל דג שהופצו ממסת התא לכיוון גוף הדג העוברי בתוך אזורים הראש והזנב 4,15; האזורים נמצאים מעבר לגבולות חלל הלב באופן חזיתי, על גבי שלפוחית השתן לשחות הגב, ומעבר לפתיחה האורוגנית caudally.
   2. עבור הזרקת דוק, לספור את מספר התאים הבודדים שפלשו סיבי הקולגן של tailfin מהמחזור (MDA-MB-231) או את מספר האשכולות שנוצרו על ידי תאים קולקטיבית (M2) ברקמה hematopoietic caudal (CHT) של כל זברהfish19.
6. למד פלישה וגרורות בפירוט רב יותר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (מומלץ מאוד).
   1. השתמש בהגדלה נמוכה (המטרה 4X) כדי לדמות את כל הגוף ולקבל סקירה של דפוס הפצת תא הגידול.
      שים לב: הגדלה גבוהה יותר (יעדים של פי 20 ו-40) מתאימה לחקר אנגיוגנזה תוך-גידולית ופרי-גידולית וללוקליזציה מדויקת של תאים מופצים בגוף העובר.
   2. השתמש לייזר 488 ננומטר כדי לסרוק את כלי הדם עובר זברה ולייזר 543 ננומטר כדי לסרוק תאים סרטניים מושתלים שכותרתו עם פלואורסצנטיות אדומה. השג תמונה באיכות גבוהה על-ידי סריקת כל עובר בשמונה עד עשרה שלבים. סרוק וממוצע בכל שלב שש פעמים.
7. בזהירות למקם את העובר בחזרה לתוך מי הביצה אם הוא נדרש לניסויים נוספים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL)	Eppendorf	F276456I
Confocal microscope	Leica	SP5 STED
Stereo microscope	Leica	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain			Kindly provided by Dr. Ewa SnaarJagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Polystyrene dish with glass bottom	WillCo	GWST-5040
Fluorescent stereo microscope	Leica	M165 FC
Tricaine (3-aminobenzoic acid)	SigmaAldrich	A-5040