Dissociation mécanique : méthode pour obtenir des cellules viables à partir d’un tissu

Overview

Cette vidéo décrit la dissociation non enzymatique du tissu humain frais pour obtenir des cellules viables. La technique est utilisée pour l’analyse qualitative et quantitative des cellules positives CD45 (lymphocytes/leucocytes) présentes dans divers tissus humains normaux et malins.

Protocol

1. Préparation de l’homogénéité tissulaire

1. Les tissus réséqués disséqués (tissus malins et normaux réséqués de la salle d’opération) sont dans le laboratoire de pathologie par du personnel qualifié pour un ramassage immédiat. La tumeur, le NANT (pris la distance la plus éloignée possible de la tumeur) et les fragments normaux de tissu sont systématiquement traités dans un délai de 1 à 3 heures de l’excision chirurgicale dans un laboratoire de BSL2 utilisant des procédures standard de biosécurité pour les tissus humains. Une carte des flux du protocole est illustrée à la figure 1.
2. Pesez tous les fragments de tissu (normale, NANT et tumeur) et mesurez la longueur, la largeur et la hauteur (longueur x largeur x hauteur). Il s’agit d’une étape importante pour la normalisation subséquente des sous-populations cellulaires, de l’ARN extrait, etc.
   REMARQUE: La plage de taille de l’échantillon est de 100 à 10 000 mm³ sans gras si possible.
3. Imprimer le fragment de tumeur sur une lame de verre pour la coloration H & E pour vérifier que le tissu fait réellement partie de la tumeur.
   1. Faites ceci en appuyant sur une glissière de microscope en verre sur le fragment de tumeur et en appliquant la pression douce avec vos doigts pendant quelques secondes.
   2. Fixer la lame avec de l’isopropanol pendant 2 min suivie d’une étape de lavage dans l’eau. Contrestain le tissu pendant 30 sec avec l’hématoxyline de Mayer.
   3. Laver la glissade dans six bains d’eau. Tache dans Phloxine B 2% pendant 15 sec.
   4. Laver dans un bain d’eau suivi de quatre bains d’isopropanol et terminer avec un bain d’eau.
   5. Incuber dans l’isopropanol pendant 1 min et égoutter. Clair dans deux bains de xylène.
   6. Montage avec support de montage à base de xylène. Examiner la cellularité tumorale (Figure 2).
      REMARQUE: Principalement, les cellules tumorales s’en tiennent à la diapositive imprimée - les cellules stromal, lymphoïdes ou adipeuses restent rarement, laissant des espaces entre les cellules tumorales (Figure 2).
4. Placez le fragment de tissu dans un petit plat de culture contenant 1 ml du milieu cellulaire hématopoïétique défini chimiquement et sans sérum (ci-après appelé moyen) à température ambiante et dés en petits morceaux (~1 - 2 mm²⁾à l’aide d’un scalpel stérile.
5. Transférer tout (fragments de tissu + milieu) dans un tube mécanique dissociateur C.
6. Rincer la boîte de Pétri et le scalpel avec 2 ml de milieu à l’aide d’une pipette Pasteur et l’ajouter au tube C (volume de milieu pour la dissociation = 3 ml).
7. Utilisez le programme de dissociateur mécanique A.01 pour les tubes C (le programme le plus doux) pour homogénéiser les fragments de tissu en une seule suspension cellulaire. Placez le tube C dans l’appareil et exécutez le programme deux fois de suite (un cycle = 25 sec).
   REMARQUE: Cette procédure d’homogénéisation a été établie et validée pour les tissus mammaires humains, d’autres types de tumeurs ou de tissus peuvent avoir besoin d’utiliser un programme différent et devraient être testés en premier.
8. Retirer le tube C de l’appareil et décanter l’homogénéisation directement dans une passoire cellulaire de 40 μm assise sur un tube de 50 ml. À l’aide de la même pipette Pasteur qu’à l’étape 1.6,transférer tout liquide restant dans le tube C à la passoire cellulaire.
9. Transférer le liquide filtré dans un tube de 15 ml à l’aide d’une pointe de micropipette de 1 ml. Gardez temporairement la passoire cellulaire et son tube de 50 ml.
10. Rincez le tube C avec 3 ml de milieu supplémentaire et transférez-le, toujours en utilisant la même pipette Pasteur qu’à l’étape 1.6,à la passoire cellulaire encore assise sur le tube de 50 ml. Presser une quantité maximale du liquide résiduel emprisonné dans le tissu non homogénéisé dans le tube de 50 ml en le déplaçant doucement autour de la passoire avec une pipette Pasteur propre ou une pointe de 1 ml qui est ensuite jetée pour éviter de contaminer l’élitate.
11. Placez la passoire cellulaire à l’envers sur le tube C d’origine et rincez avec 3 ml de milieu afin que le tissu non homogénéisé retotte dans le tube C.
12. Re-homogénéiser comme à l’étape 1.7 pour deux cycles du programme A.01.
13. Verser ce deuxième homogénéité à travers la passoire cellulaire assise sur le tube de 50 ml, rincer le tube C à nouveau avec 3 ml de milieu (comme à l’étape 1.10) et transférer avec la pipette Pasteur à la passoire cellulaire assise sur le tube de 50 ml à nouveau presser une quantité maximale de liquide du tissu conjonctif résiduel emprisonné dans la passoire cellulaire.
14. À ce stade, un volume de ~2,5 ml se trouve dans le tube de 15 ml et ~9 ml dans le tube de 50 ml.

2. Séparation du supernatant tissulaire et des cellules

1. Centrifugeuse les homogénéises dans les tubes de 15 ml et 50 ml pendant 15 min à 600 x g à température ambiante.
2. Décanter le SN du tube de 15 ml dans un tube propre et le conserver temporairement à 4 °C. Ce supernatant = tumeur primaire, NANT ou tissu normal SN (volume final 2,5 ml) est par la suite clarifié et aliquoted avant stockage à -80 °C pour des analyses futures (voir ci-dessous).
3. Jeter le surnatant du tube de 50 ml.
4. Resuspendez doucement les deux granulés cellulaires dans un volume final de 1 ml moyen. Brièvement, d’abord briser doucement la pastille cellulaire dans les deux tubes (en appuyant sur le tube sur une surface dure). Resuspendez la pastille cellulaire lâche dans les 50 ml avec 500 μl de milieu et transférez cette suspension cellulaire dans le tube de 15 ml pour résuspendre la deuxième pastille. Répétez cette étape une fois avec le deuxième 500 μl de milieu pour une récupération maximale des cellules.
5. Transférer 10 μl de la suspension cellulaire dans un petit tube, mélanger avec 10 μl de trypan bleu (dilution 1:1) et compter le nombre de cellules viables à l’aide d’un hémomètre.
   REMARQUE: À ce stade, une fraction de la suspension cellulaire peut également être analysée par cytométrie d’écoulement pour évaluer la taille des cellules, la granularité et si désiré un nombre limité de marqueurs de sous-population pour une évaluation plus précise de la distribution relative des cellules dans l’homogénéité avant une analyse approfondie ou une expérimentation. Toutes les analyses par cytométrie de débit intègrent l’étiquetage CD45 pour la normalisation des sous-populations.
6. Pelleter les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 10 min à température ambiante. Les cellules de la tumeur, NANT, ou tissu normal sont maintenant prêtes pour davantage de purification ou d’analyse. Ces étapes supplémentaires sont préférables lorsqu’elles sont effectuées le même jour que la chirurgie.
   REMARQUE: Pour l’analyse cytométrique de flux mais pas le tri cellulaire, les globules rouges résiduels doivent être lysés après l’étiquetage des anticorps en ajoutant 0,4 ml de tampon de lyse des globules rouges à la pastille cellulaire, en tourbillonnant immédiatement pendant 1 sec et en incubant un minimum de 10 min à température ambiante (à l’abri de la lumière) avant analyse.

3. Clarification du supernatant tissulaire

1. Centrifugeuse les tubes de 1,5 ml avec tissu SN à 15 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
2. Retirer délicatement le surnatant sans toucher ou déranger la pastille. Transférer dans un tube propre (ou tubes) en fonction du nombre et du volume d’aliquots désirés.
3. Conserver le supernatant à -80 °C pour une utilisation future.

Representative Results

Figure 1 : Diagramme de flux de protocole. Notre procédure de traitement des tissus humains frais et certaines approches analytiques qui peuvent ensuite être utilisées pour évaluer les lymphocytes infiltrant les tissus humains sont montrées.

Figure 2 : Image souillée de H&E d’une empreinte de tissu de tumeur de sein. Cette empreinte, tirée d’un fragment frais de tissu tumoral du sein, montre la présence de cellules tumorales avec les espaces ouverts reflétant les zones qui n’ont pas été transférées.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield		640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain