Mekanisk dissociation: En metode til at opnå levedygtige celler fra et væv

Overview

Denne video beskriver den ikke-enzymatiske dissociation af frisk humant væv for at opnå levedygtige celler. Teknikken anvendes til kvalitativ og kvantitativ analyse af CD45 positive celler (lymfocytter/ leukocytter), der findes i forskellige normale og ondartede humane væv.

Protocol

1. Forberedelse af vævs homogenatet

1. Dissekeret resected væv (ondartet og normalt væv resected fra operationsstuen) er i patologi lab af uddannet personale til øjeblikkelig afhentning. Tumor, NANT (taget længst afstand fra tumoren som muligt) og normale vævsfragmenter behandles rutinemæssigt inden for 1 - 3 timers kirurgisk udskæring i et BSL2-laboratorium ved hjælp af standard biosikkerhedsprocedurer for humant væv. Et rutediagram over protokollen er illustreret i figur 1.
2. Vej alle vævsfragmenter (normal, NANT og tumor) og mål længde, bredde og højde (længde x bredde x højde). Dette er et vigtigt skridt for den efterfølgende normalisering af celleunderpopulationer, ekstraheret RNA osv.
   BEMÆRK: Prøvestørrelsen er mellem 100 og 10.000 mm³ uden fedt, hvis det er muligt.
3. Aftryk tumor fragmentet på et glas dias for H & E farvning at kontrollere, at vævet er faktisk en del af tumoren.
   1. Gør dette ved at trykke på et glasmikroskop glide på tumorfragmentet og anvende blidt tryk med fingrene i et par sekunder.
   2. Fastgør rutsjebanen med isopropanol i 2 minutter efterfulgt af et vasketrin i vand. Plette vævet i 30 sekunder med Mayers hematoxylin.
   3. Vask rutsjebanen i seks bade med vand. Plet i Phloxine B 2% i 15 sek.
   4. Vask i et bad af vand efterfulgt af fire bade af isopropanol og af med et bad af vand.
   5. Inkuber i isopropanol i 1 min og afløb. Klar i to bade af xylen.
   6. Monter med xylenbaseret monteringsmedium. Undersøg for tumorcellulæritet (Figur 2).
      BEMÆRK: Hovedsageligt, tumorceller holde sig til den præget dias - den stromale, lymfoide eller fedtceller sjældent tilbage, forlader mellemrum mellem tumorceller(Figur 2).
4. Vævsfragmentet anbringes i en lille dyrkningsskål, der indeholder 1 ml af det kemisk definerede, serumfrie hæmatopoietiske cellemedium (i det følgende benævnt middel) ved stuetemperatur, og skær det i små stykker (~1 - 2 mm²) ved hjælp af en steril skalpel.
5. Overfør alt (vævsfragmenter + medium) til et mekanisk dissociator C-rør.
6. Petri skålen og skalpel med 2 ml medium ved hjælp af en Pasteur pipette og tilsæt dette til C-røret (volumen af medium til dissociation = 3 ml).
7. Brug det mekaniske dissociatorprogram A.01 til C-rør (det mest blide program) til at homogenisere vævsfragmenterne til en enkelt celleaffjedring. Sæt C-røret i apparatet, og kør programmet to gange i træk (en cyklus = 25 sek.).
   BEMÆRK: Denne homogenisering procedure er blevet etableret og valideret for humant brystvæv, andre tumor eller væv typer kan være nødvendigt at bruge et andet program og bør testes først.
8. C-røret tages ud af apparatet, og homogenatet dekanteres direkte til en 40 μm cellestive, der sidder på et 50 ml rør. Ved hjælp af den samme Pasteur-pipette som i trin 1.6overføres væske, der er tilbage i C-røret, til cellesien.
9. Den filtrerede væske overføres til et 15 ml rør ved hjælp af en 1 ml mikropipettespids. Hold midlertidigt cellesien og dens 50 ml rør.
10. C-røret skylles med yderligere 3 ml medium, og dette overføres igen ved hjælp af den samme Pasteur-pipette som i trin 1.6til den cellesien, der stadig sidder på 50 ml røret. Klem en maksimal mængde af den resterende væske, der er fanget i det uhomogeniserede væv, ind i 50 ml røret ved forsigtigt at flytte den rundt om sien med en ren Pasteur-pipette eller 1 ml spids, der efterfølgende smides væk for at undgå at forurene eluatet.
11. Læg cellesien på hovedet på det originale C-rør, og skyl med 3 ml medium, så det uhomogeniserede væv falder tilbage i C-røret.
12. Homogeniser igen som i trin 1.7 for to cyklusser af A.01-programmet.
13. Denne anden homogeniseres gennem cellesien, der sidder på 50 ml røret, C-røret skylles igen med 3 ml medium (som i trin 1.10)og overføres med Pasteur-pipetten til cellesien, der sidder på 50 ml-røret igen og klemmer en maksimal mængde væske fra det resterende bindevæv, der er fanget i cellesien.
14. På dette tidspunkt er der et volumen på ~ 2,5 ml i 15 ml røret og ~ 9 ml i 50 ml røret.

2. Adskillelse af vævs supernatant og celler

1. Centrifuger homogeniteterne i 15 ml og 50 ml rør i 15 minutter ved 600 x g ved stuetemperatur.
2. SN'et dekanteres fra 15 ml røret til et rent rør og opbevares midlertidigt ved 4 °C. Dette supernatant = primær tumor, NANT eller normalt væv SN (slutvolumen 2,5 ml) afklares efterfølgende og aliquoted før opbevaring ved -80 °C til fremtidige analyser (se nedenfor).
3. Supernatanten kasseres fra 50 ml røret.
4. Resuspend forsigtigt begge cellepiller i et sidste volumen på 1 ml medium. Kort, først forsigtigt bryde celle pellet i begge rør (ved at trykke på røret på en hård overflade). Den løse cellepille blev genbrugt i 50 ml med 500 μl medium, og denne celleaffjedring overføres til 15 ml røret for at genbruge den anden pellet. Gentag dette trin én gang med det andet medium på 500 μl for maksimal genvinding af celler.
5. 10 μl af celleaffjedringen overføres til et lille rør, blandes med 10 μl trypanblå (fortynding 1:1) og antallet af levedygtige celler tælles ved hjælp af et hæmocytometer.
   BEMÆRK: På dette tidspunkt kan en brøkdel af celleaffjedringen også analyseres ved flowcytometri for at evaluere cellestørrelse, granularitet og om ønsket et begrænset antal delpopulationsmarkører for en mere præcis vurdering af den relative cellefordeling i homogenatet forud for omfattende analyse eller eksperimentering. Alle analyser af flowcytometry omfatter CD45-mærkning til normalisering af delpopulationer.
6. Pellet cellerne ved centrifugering ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Cellerne fra tumoren, NANT eller normalt væv er nu klar til yderligere rensning eller analyse. Disse yderligere trin er bedst, når de udføres på samme dag som kirurgi.
   BEMÆRK: For flow cytometrisk analyse, men ikke cellesortering de resterende røde blodlegemer skal lyses efter antistof mærkning ved at tilføje 0,4 ml af røde blodlegemer lysis buffer til cellepille, straks hvirvlende i 1 sek og inkubere mindst 10 min ved stuetemperatur (beskyttet mod lys) før analyse.

3. Præcisering af vævs-supernatanten

1. 1,5 ml rør med væv SN ved 15.000 x g i 15 minutter ved 4 °C cent.
2. Fjern forsigtigt supernatanten uden at røre ved eller forstyrre pelleten. Overfør til et rent rør (eller rør) afhængigt af antallet og mængden af aliquots ønskede.
3. Supernatanten opbevares ved -80 °C til fremtidig brug.

Representative Results

Figur 1: Protokolrutediagram. Vores procedure for behandling af friske humane væv og nogle analytiske tilgange, der efterfølgende kan bruges til at vurdere lymfocytter infiltrere humane væv er vist.

Figur 2: H&E farvet billede af et brysttumorvævsaftryk. Dette aftryk, taget fra en frisk bryst tumor væv fragment, viser tilstedeværelsen af tumorceller med de åbne rum afspejler områder, der ikke blev overført.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield		640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain