Overview
Deze video beschrijft de niet-enzymatische dissociatie van vers menselijk weefsel om levensvatbare cellen te verkrijgen. De techniek wordt gebruikt voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse van CD45 positieve cellen (lymfocyten/leukocyten) aanwezig in verschillende normale en kwaadaardige menselijke weefsels.
Protocol
1. Bereiding van het weefselhomogenaat
- Ontleed geresectiede weefsels (kwaadaardig en normaal weefsel gereseceerd uit de operatiekamer) bevinden zich in het pathologielab door opgeleid personeel voor onmiddellijke pick-up. Tumor, NANT (zo ver mogelijk van de tumor verwijderd) en normale weefselfragmenten worden routinematig verwerkt binnen 1 - 3 uur na chirurgische excisie in een BSL2-laboratorium met behulp van standaard bioveiligheidsprocedures voor menselijke weefsels. Een stroomschema van het protocol wordt geïllustreerd in figuur 1.
- Weeg alle weefselfragmenten (normaal, NANT en tumor) en meet de lengte, breedte en hoogte (lengte x breedte x hoogte). Dit is een belangrijke stap voor de daaropvolgende normalisatie van celsubpopulaties, geëxtraheerd RNA, enz.
OPMERKING: Het bereik van de steekproefgrootte is 100 tot 10.000 mm3 zonder vet indien mogelijk. - Druk het tumorfragment op een glazen dia voor H&E-kleuring om te controleren of het weefsel daadwerkelijk deel uitmaakt van de tumor.
- Doe dit door een glazen microscoopschuif op het tumorfragment te drukken en een paar seconden zachte druk uit te oefenen met uw vingers.
- Bevestig de glijbaan met isopropanol gedurende 2 minuten, gevolgd door een wasstap in water. Counterstain het weefsel gedurende 30 seconden met Mayer's hematoxyline.
- Was de glijbaan in zes baden water. Vlek in Phloxine B 2% gedurende 15 sec.
- Was in één bad water gevolgd door vier baden isopropanol en eindig met één bad water.
- Incubeer in isopropanol gedurende 1 min en giet af. Helder in twee baden van xyleen.
- Mount met xyleen gebaseerd montagemedium. Onderzoek op tumorcellaliteit (figuur 2).
OPMERKING: Tumorcellen kleven voornamelijk aan de ingeprente dia - de stromale, lymfoïde of vetcellen blijven zelden achter, waardoor er ruimte overblijft tussen de tumorcellen (figuur 2).
- Plaats het weefselfragment in een kleine kweekschaal met 1 ml van het chemisch gedefinieerde, serumvrije hematopoëtische celmedium (hierna medium genoemd) op kamertemperatuur en snijd het in kleine stukjes (~1 - 2 mm2) met behulp van een steriele scalpel.
- Breng alles (weefselfragmenten + medium) over naar een mechanische dissociator C-buis.
- Spoel de Petrischaal en scalpel af met 2 ml medium met een Pasteur pipet en voeg dit toe aan de C-tube (volume medium voor dissociatie = 3 ml).
- Gebruik het mechanische dissociatorprogramma A.01 voor C-buizen (het meest zachte programma) om de weefselfragmenten te homogeniseren tot een enkele celsuspensie. Plaats de C-buis in het apparaat en voer het programma twee keer achter elkaar uit (één cyclus = 25 sec).
OPMERKING: Deze homogenisatieprocedure is vastgesteld en gevalideerd voor menselijk borstweefsel, andere tumor- of weefseltypen moeten mogelijk een ander programma gebruiken en moeten eerst worden getest. - Verwijder de C-buis uit het apparaat en decanteer het homogenaat rechtstreeks in een 40 μm celzeef die op een buis van 50 ml zit. Breng met dezelfde Pasteur pipet als in stap 1.6alle vloeistof die overblijft in de C-buis over naar de celzeef.
- Breng de gefilterde vloeistof over in een buis van 15 ml met behulp van een micropipettip van 1 ml. Houd de celzeef en de buis van 50 ml tijdelijk.
- Spoel de C-buis af met nog eens 3 ml medium en breng deze, opnieuw met dezelfde Pasteur-pipet als in stap 1.6,over naar de celzeef die nog steeds op de buis van 50 ml zit. Knijp een maximale hoeveelheid van de resterende vloeistof die in het niet-homogeniseerde weefsel is opgesloten in de buis van 50 ml door deze voorzichtig rond de zeef te bewegen met een schone Pasteur pipet of 1 ml punt die vervolgens wordt weggegooid om besmetting van het eluaat te voorkomen.
- Plaats de celzeef ondersteboven op de originele C-buis en spoel af met 3 ml medium, zodat het niet-gehomogeniseerde weefsel terugvalt in de C-buis.
- Herhomogeniseer zoals in stap 1.7 voor twee cycli van het A.01-programma.
- Giet dit tweede homogenaat door de celzeef die op de buis van 50 ml zit, spoel de C-buis opnieuw af met 3 ml medium (zoals in stap 1.10) en breng met de Pasteurpipet over naar de celzeef die op de buis van 50 ml zit en knijp opnieuw een maximale hoeveelheid vloeistof uit het resterende bindweefsel dat in de celzeef zit.
- Op dit punt bevindt zich een volume van ~ 2,5 ml in de buis van 15 ml en ~ 9 ml in de buis van 50 ml.
2. Scheiding van het weefsel supernatans en cellen
- Centrifugeer de homogenaten in de tubes van 15 ml en 50 ml gedurende 15 minuten bij 600 x g bij kamertemperatuur.
- Decanteer de SN uit de buis van 15 ml in een schone buis en bewaar deze tijdelijk bij 4 °C. Deze supernatant = primaire tumor, NANT of normaal weefsel SN (eindvolume 2,5 ml) wordt vervolgens verduidelijkt en aliquoted voorafgaand aan opslag bij -80 °C voor toekomstige analyses (zie hieronder).
- Gooi het supernatant uit de tube van 50 ml.
- Resuspend beide celkorrels voorzichtig in een eindvolume van 1 ml medium. Breek kort de celkorrel eerst voorzichtig in beide buizen (door op de buis op een hard oppervlak te tikken). Resuspend de losse celkorrel in de 50 ml met 500 μl medium en breng deze celsuspensie over naar de buis van 15 ml om de tweede pellet te resuspenden. Herhaal deze stap eenmaal met de tweede 500 μl medium voor maximaal herstel van cellen.
- Breng 10 μl van de celsuspensie over in een kleine buis, meng met 10 μl trypanblauw (verdunning 1:1) en tel het aantal levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer.
OPMERKING: Op dit punt kan een fractie van de celsuspensie ook worden geanalyseerd door flowcytometrie om de celgrootte, granulariteit en indien gewenst een beperkt aantal subpopulatiemarkers te evalueren voor een nauwkeurigere beoordeling van de relatieve celverdeling in het homogenaat voorafgaand aan uitgebreide analyse of experimenten. Alle analyses per flow cytometrie bevatten CD45-etikettering voor normalisatie van subpopulaties. - Pellet de cellen door centrifugeren op 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. De cellen van de tumor, NANT of normaal weefsel zijn nu klaar voor verdere zuivering of analyse. Deze extra stappen zijn het beste wanneer ze op dezelfde dag als de operatie worden uitgevoerd.
OPMERKING: Voor flowcytometrische analyse, maar niet voor celsortering, moeten de resterende rode bloedcellen na antilichaametikettering worden gelyseerd door 0,4 ml rode bloedcellysisbuffer aan de celkorrel toe te voegen, onmiddellijk gedurende 1 seconde te vortexen en vóór de analyse minimaal 10 minuten bij kamertemperatuur (beschermd tegen licht) te broeden.
3. Verduidelijking van het weefsel supernatans
- Centrifugeer de buisjes van 1,5 ml met weefsel SN bij 15.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant voorzichtig zonder de pellet aan te raken of te verstoren. Breng over in een schone buis (of buizen) afhankelijk van het gewenste aantal en volume aliquots.
- Bewaar het supernatant bij -80 °C voor toekomstig gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1: Protocolstroomdiagram. Onze procedure voor het verwerken van verse menselijke weefsels en enkele analytische benaderingen die vervolgens kunnen worden gebruikt om lymfocyten te beoordelen die menselijke weefsels infiltreren, worden getoond.
Figuur 2: H&E bevlekte afbeelding van een borsttumor weefsel afdruk. Deze afdruk, afkomstig van een vers borsttumorweefselfragment, toont de aanwezigheid van tumorcellen met de open ruimtes die gebieden weerspiegelen die niet zijn overgedragen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
GentleMacs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | BD Medimachine is somewhat equivalent |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | or other standard table top centrifuge | |
Centrifuge 5417 R | Eppendorf | or other standard microcentrifuge | |
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet | ESCO global | or other standard BSL2 hood | |
Inverted Microscope | Nikon eclipse TS100 | or other microscope compatible for a hemacytometer | |
Bürker Chamber Marienfield | 640210 | or other standard hemacytometer | |
Navios Flow Cytometer | Beckman Coulter | or other flow cytometer (8-10 color recommended) | |
GentleMacs C-Tube | Miltenyi Biotec | 130-096-344 | BD Medimachine uses Filcon |
Cell Culture Dish | Sarstedt | 72,710 | or other non-pyrogenic plasticware |
Disposable Scalpel | Swann-Morton | 510 | or standard single use sterile scalpel |
BD Cell Strainer 40 µm | Becton Dickinson | 734-0002 | or other non-pyrogenic plasticware |
BD Falcon Tube 50 ml | Becton Dickinson | 352070 | or other non-pyrogenic plasticware |
BD Falcon Tube 15 ml | Becton Dickinson | 352097 | or other non-pyrogenic plasticware |
BD FACS Tube 5 ml | Becton Dickinson | 352008 | or other non-pyrogenic plasticware |
Sterile Pasteur Pipette 5 ml | VWR | 612-1685 | or other non-pyrogenic plasticware |
Microfuge Tube 1.5 ml | Eppendorf | 7805-00 | or other non-pyrogenic plasticware |
X-Vivo 20 | Lonza | BE04-448Q | serum-free medium recommended |
Phosphate buffered saline | Lonza | BE17-516F | standard physiological PBS |
Trypan blue | VWR | 17942E | or other vital stain |