Mechanische Dissoziation: Eine Methode, um lebensfähige Zellen aus einem Gewebe zu erhalten

Overview

Dieses Video beschreibt die nicht-enzymatische Dissoziation von frischem menschlichem Gewebe, um lebensfähige Zellen zu erhalten. Die Technik wird zur qualitativen und quantitativen Analyse von CD45-positiven Zellen (Lymphozyten/Leukozyten) in verschiedenen normalen und bösartigen menschlichen Geweben verwendet.

Protocol

1. Vorbereitung des Gewebehomogenats

1. Sesektierte Gewebe (bösartiges und normales Gewebe aus dem Operationssaal resektiert) befinden sich im Pathologielabor von geschultem Personal für die sofortige Abholung. Tumor, NANT (möglichst weit vom Tumor entfernt) und normale Gewebefragmente werden routinemäßig innerhalb von 1 - 3 Stunden chirurgischer Exzision in einem BSL2-Labor unter Verwendung von Standard-Biosicherheitsverfahren für menschlichegewebe verarbeitet. Ein Flussdiagramm des Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt.
2. Wiegen Sie alle Gewebefragmente (Normal, NANT und Tumor) und messen Sie Länge, Breite und Höhe (Länge x Breite x Höhe). Dies ist ein wichtiger Schritt für die anschließende Normalisierung von Zellsubpopulationen, extrahierter RNA usw.
   HINWEIS: Der Probenumfang beträgt 100 bis 10.000 mm³ ohne Fett, wenn möglich.
3. Prägen Sie das Tumorfragment auf einem Glasschlitten für Die H&E-Färbung, um zu überprüfen, ob das Gewebe tatsächlich Teil des Tumors ist.
   1. Drücken Sie dazu ein Glasmikroskop-Dia auf das Tumorfragment und wenden Sie für ein paar Sekunden sanften Druck mit den Fingern an.
   2. Fixieren Sie die Rutsche mit Isopropanol für 2 min gefolgt von einem Waschschritt in Wasser. Gegendas Gewebe 30 Sek. mit Mayers Hämatoxylin.
   3. Waschen Sie die Rutsche in sechs Bädern mit Wasser. Fleck in Phloxin B 2% für 15 Sek.
   4. Waschen Sie in einem Bad mit Wasser, gefolgt von vier Bädern von Isopropanol und beenden Sie mit einem Bad Wasser.
   5. Inkubieren in Isopropanol für 1 min und abtropfen lassen. Klar in zwei Bädern von Xylol.
   6. Montage mit Xylol-basiertem Montagemedium. Untersuchen Sie die Tumorzelllichkeit (Abbildung 2).
      HINWEIS: Hauptsächlich kleben Tumorzellen an der aufgedruckten Folie - die stromalen, lymphoiden oder fettigen Zellen bleiben selten und lassen Zwischenräume zwischen den Tumorzellen zurück (Abbildung 2).
4. Legen Sie das Gewebefragment in eine kleine Kulturschale, die 1 ml des chemisch definierten, serumfreien hämatopoetischen Zellmediums (nachfolgend als Medium bezeichnet) bei Raumtemperatur enthält, und würfeln Sie es mit einem sterilen Skalpell in kleine Stücke (1 - 2 mm²).
5. Übertragen Sie alles (Gewebefragmente + Medium) auf ein mechanisches Dissoziator C-Rohr.
6. Spülen Sie die Petrischale und das Skalpell mit 2 ml Medium mit einer Pasteur Pipette und fügen Sie diese in das C-Rohr (Volumen des Mediums zur Dissoziation = 3 ml).
7. Verwenden Sie das mechanische Dissoziatorprogramm A.01 für C-Röhren (das schonendste Programm), um die Gewebefragmente in eine einzelzellige Suspension zu homogenisieren. Legen Sie das C-Rohr in das Gerät und führen Sie das Programm zweimal hintereinander aus (ein Zyklus = 25 Sek.).
   HINWEIS: Dieses Homogenisierungsverfahren wurde für menschliches Brustgewebe etabliert und validiert, andere Tumor- oder Gewebetypen müssen möglicherweise ein anderes Programm verwenden und sollten zuerst getestet werden.
8. Entfernen Sie das C-Rohr aus dem Gerät und dekanieren Sie das Homogenat direkt in ein 40-mm-Zellsieb, das auf einem 50 ml-Rohr sitzt. Mit der gleichen Pasteur Pipette wie in Schritt 1.6, übertragen Sie alle Flüssigkeit, die im C-Rohr verbleibt, auf das Zellsieb.
9. Übertragen Sie die gefilterte Flüssigkeit mit einer 1 ml Mikropipette-Spitze in ein 15 ml-Röhrchen. Bewahren Sie das Zellsieb und seine 50 ml Tube vorübergehend auf.
10. Spülen Sie das C-Rohr mit einem zusätzlichen 3 ml Medium und übertragen Sie diese wiederum mit der gleichen Pasteur-Pipette wie in Schritt 1.6auf das noch auf dem 50 ml-Rohr sitzende Zellsieb. Drücken Sie eine maximale Menge der im unhomogenisierten Gewebe eingeschlossenen Restflüssigkeit in das 50 ml-Rohr, indem Sie es vorsichtig mit einer sauberen Pasteur-Pipette oder 1 ml-Spitze um das Sieb bewegen, die anschließend weggeworfen wird, um eine Kontamination des Eluats zu vermeiden.
11. Legen Sie das Zellsieb auf den Kopf auf das ursprüngliche C-Rohr und spülen Sie es mit 3 ml Medium ab, so dass das unhomogenisierte Gewebe wieder in die C-Röhre fällt.
12. Re-Homogenisieren wie in Schritt 1.7 für zwei Zyklen des A.01-Programms.
13. Gießen Sie dieses zweite Homogenat durch das auf dem 50 ml-Röhrchen sitzende Zellsieb, spülen Sie das C-Rohr wieder mit 3 ml Medium (wie in Schritt 1.10) ab und übertragen Sie mit der Pasteurpipette auf das auf dem 50 ml-Röhrchen sitzende Zellsieb, das eine maximale Flüssigkeitsmenge aus dem im Zellsieb eingeschlossenen Rest-Bindegewebe drückt.
14. An dieser Stelle befindet sich ein Volumen von 2,5 ml in der 15 ml-Tube und 9 ml in der 50-ml-Tube.

2. Trennung von Gewebeüberstand und Zellen

1. Zentrifugieren Sie die Homogenate in den 15 ml und 50 ml Tuben für 15 min bei 600 x g bei Raumtemperatur.
2. Den SN aus dem 15 ml-Rohr in ein sauberes Rohr dekantieren und vorübergehend bei 4 °C lagern. Dieser Überstand = Primärtumor, NANT oder normales Gewebe SN (Endvolumen 2,5 ml) wird anschließend geklärt und vor der Lagerung bei -80 °C für zukünftige Analysen alizitiert (siehe unten).
3. Entsorgen Sie den Überstand aus dem 50 ml-Röhrchen.
4. Beide Zellpellets in einem Endvolumen von 1 ml Mittel vorsichtig wieder aufhängen. Kurz gesagt, brechen Sie zuerst vorsichtig das Zellpellet in beiden Rohren (durch Antippen des Rohres auf einer harten Oberfläche). Setzen Sie das lose Zellpellet in den 50 ml mit 500 l Medium wieder auf und übertragen Sie diese Zellsuspension in die 15 ml Tube, um das zweite Pellet wieder aufzuhängen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal mit dem zweiten Medium 500 l für eine maximale Wiederherstellung der Zellen.
5. Übertragen Sie 10 l der Zellsuspension in ein kleines Röhrchen, mischen Sie sie mit 10 l Trypanblau (Verdünnung 1:1) und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer.
   HINWEIS: An dieser Stelle kann ein Bruchteil der Zellsuspension auch durch Durchflusszytometrie analysiert werden, um Zellgröße, Granularität und, falls gewünscht, eine begrenzte Anzahl von Subpopulationsmarkern zu bewerten, um die relative Zellverteilung im Homogenat vor umfangreichen Analysen oder Experimenten genauer zu beurteilen. Alle Analysen durch Durchflusszytometrie enthalten CD45-Kennzeichnung zur Normalisierung von Subpopulationen.
6. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Die Zellen aus dem Tumor, NANT oder normalem Gewebe sind nun bereit für weitere Reinigung oder Analyse. Diese zusätzlichen Schritte sind am besten, wenn sie am selben Tag wie eine Operation durchgeführt werden.
   HINWEIS: Für die zytometrische Durchflussanalyse, aber nicht für die Zellsortierung sollten die verbleibenden roten Blutkörperchen nach der Antikörperkennzeichnung lysiert werden, indem dem Zellpellet 0,4 ml roter Blutzelllysepuffer hinzugefügt, der sofort 1 Sek. wirbelt und vor der Analyse mindestens 10 min bei Raumtemperatur (lichtgeschützt) inkubiert wird.

3. Klärung des Gewebeüberstandes

1. Zentrifugieren Sie die 1,5 ml Tuben mit Gewebe SN bei 15.000 x g für 15 min bei 4 °C.
2. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu berühren oder zu stören. Transfer in ein sauberes Rohr (oder Rohre) in Abhängigkeit von der Anzahl und dem Volumen der Aliquots gewünscht.
3. Bewahren Sie den Überstand bei -80 °C für die zukünftige Verwendung auf.

Representative Results

Abbildung 1: Protokollflussdiagramm. Unser Verfahren zur Verarbeitung von frischem menschlichem Gewebe und einige analytische Ansätze, die anschließend zur Beurteilung von Lymphozyten verwendet werden können, die menschlichegewebe infiltrieren, werden gezeigt.

Abbildung 2: H&E-gefärbtes Bild eines Brusttumor-Gewebeabdrucks. Dieser Abdruck, der aus einem frischen Brusttumor-Gewebefragment stammt, zeigt das Vorhandensein von Tumorzellen mit den offenen Räumen, die Bereiche reflektieren, die nicht übertragen wurden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield		640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain