Summary
Erken embriyonik akciğer organ kültürü epitelyal-mezenkimal etkileşimleri çalışmak için çok yararlı bir sistem. , Bu sistem içinde kolaylıkla manipüle edilebilir belirli koşullar altında epitelyal ve mezenkimal morfolojilerinden ilerler.
Abstract
Akciğer ilkel şartnamesi dallanma morfolojilerinden yanı sıra, çeşitli akciğer hücre soylarının oluşumu çevresindeki mezenşimin ve Mesothelium akciğer endoderm belirli bir etkileşim gerektirir. Akciğer mezenşimin akciğer dallanma morfolojilerinden için endüktif sinyallerin kaynağı olarak gösterilmiştir. Epitel-mezenkimal mezotel etkileşimleri de embriyonik akciğer morfolojilerinden için kritik öneme sahiptir. Erken embriyonik akciğer organ kültürü epitelyal-mezenkimal etkileşimleri çalışmak için çok yararlı bir sistem. (Anne etki ve kan akışını yokluğunda) bu sistemde kolayca manipüle edilebilir belirli koşullar altında epitelyal ve mezenkimal morfolojilerinden ilerler. Daha da önemlisi bu teknik bir serumless, kimyasal olarak tanımlanmış bir kültür ortamı kolaylıkla yapılabilir. Kazanç ve fonksiyon kaybı ifade proteinler, Rekombinant viral vektörlerin ve / veya transgenik fare suşlarının, antisens RNA, RNA girişim yanı sıra gen demonte analizi kullanılarak elde edilebilir.
Protocol
Organ kültür, gen ve protein ifade çalışmak için çok yararlı ve çok yönlü bir tekniktir. Bu ex vivo kültür yöntemleri, in vivo çalışmalar tamamlayıcı olarak veya ön kullanılabilir .
1. Embriyonik Akciğer izolasyonu
- Zamanlı gebe farelerin NIH ve OLAW kurallarına göre CO 2 narkoz postcoitum gün 11.5 veya 12.5 (E11.5-12.5) kurban. Hayvan bir odaya yerleştirilir ve% 100 CO 2 tanıtıldı. Hayvan bilinçsiz sonra CO 2 akışını artırmıştır. Klinik ölüm hayvan sağlanmalıdır.
- Aşağıdaki adımların hepsi bir laminer akış kaputu steril koşullar altında tamamlanması gerekir. Hamile kadınlarda rahim kaldırılır. Hayvan rahim kaldırmak için, hamile kadınlarda sırt yerleştirilir ve% 70 etanol ile püskürtülür. Karında bir kesi yapılır ve deri hayvanın arka ayakları tutarak cildi yukarı çekerek kaldırılır. Periton boşluğuna açılır ve rahim hayvan kaldırılır.
- Kan soğuk Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile dolu bir 50 ml konik tüp içinde rahim koyarak durulanır ve tüp, 2 dakika boyunca hafifçe derinden sarsılır.
- Rahim sonra bir Petri kabındaki Anatomi stereoskopik mikroskop altında yerleştirilir ve embriyoların rahim duvarına incising yaylı makas kullanılarak rahim serbest bırakıldı. Embriyolar delikli bir kaşık kullanarak hasat ve HBSS içeren yeni bir Petri kabındaki buz üzerinde yerleştirilir.
- Anatomi stereoskopik mikroskop altında, embriyonik akciğerleri soğuk HBSS (Şekil 1) içeren bir Petri kabındaki tek tek disseke edilir.
- Izole, steril bir transfer pipet kullanarak HBSS içeren bir Petri kabındaki embriyonik akciğer buz üzerinde yer almaktadır.
2. Embriyonik Akciğer Kültürü
- 1 mililitre başına iyi D-MEM/F-12 500 mikrolitre Penisilin-Streptomisin 50 ünite / ml ile desteklenmiş bir Nunclon Polistiren çanak eklenir.
- Nuclepore Polikarbonat Parça-Etch Membran medyanın üstüne yerleştirilir. Nuclepore Polikarbonat Track-Etch Membran medyanın üstüne yerleştirildiğinde, parlak tarafı, medya, ve kaba yan yukarı bakacak karşı olduğundan emin olun.
- Disseke embriyonik akciğer, steril bir transfer pipet kullanarak Nuclepore Polikarbonat Parça-Asitli Membran üstüne yerleştirilir.
- Forseps kullanarak embriyonik akciğer pozisyonu ayarlanır. Embriyonik akciğer filtre üzerine yerleştirilmiş sağlam bir trakea olmalıdır ve düz bir konuma sahip trakea ile yerleştirilir, böylece tüm akciğerleri aynı iç basınç olanak sağlar.
- Nunclon Polistiren çanak bir hücre inkübatör (Şekil 2) istenen kültür kez aktarılır.
3. Malzemeler
1. Embriyonik Tüm Akciğer İzolasyon
- Zamanlı gebe (C57BL6 vahşi tip veya transgenik) farelerde postcoitum gün 11.5 13.5 (E11.5-13.5) feda olsun.
- Kalsiyum klorür, magnezyum klorür, magnezyum sülfat olmadan Hanks 'Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) (1X), sıvı,. (Invitrogen, Carlsbad, CA), 50 ünite / ml Penisilin-Streptomisin (Invitrogen, Carlsbad, CA) ile desteklenmiştir. 4 ° C açıldıktan sonra oda sıcaklığında ve HBSS saklayın. Kısım ve mağaza -20 ° C'de Penisilin-Streptomisin
- Anatomi stereoskopik mikroskop (Leica, Wetzlar, Almanya).
- Dumont forseps, Güzel iris makası (düz), Noyes yaylı makas ve Moria ® kaşık (perfore) (Güzel Bilim Araçlar, Foster City, CA) de dahil olmak üzere Diseksiyon araçları.
2. Embriyonik Tüm Akciğer Kültür
- Orta Dulbecco'nun Modifiye Kartalı: Besin Mix F-12 (D-MEM/F-12) (1X), sıvı, 1:1 L-glutamin içerir, ancak hiçbir HEPES tamponu. (Invitrogen, Carlsbad, CA), 50 ünite / ml Penisilin-Streptomisin (Invitrogen, Carlsbad, CA) ile desteklenmiştir. 4 DMEM/F-12 ışık (örneğin, alüminyum folyo kaplı) uzak şişe ve mağaza ° C tutun Kısım ve mağaza -20 ° C'de Penisilin-Streptomisin
- Nuclepore Polikarbonat Parça-Asitli Membran, 8.0 m, 13mm (whatman Nuclepore Parça-Etch membran (Whatman Florham Park, NJ).
- Kapaklı Nunclon Polistiren çanak, 4 kuyu (Rochester, NY).
- Tek kullanımlık transferi pipetler, steril (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).
Şekil 1. E12 embriyonik akciğerler Diseksiyon. (A) E12.5 bütün embriyo sağ tarafında (B) Sağ ön ayakları embriyo çıkarıldı (C), sabit çanak embriyo tutan sol el tarafından tutulan Forseps . Oklar (D) Embriyonik akciğer, kalp (kaldırıldığında arka yatıyor diseksiyon planı ;Omurga) ve anterior. Bu rakam, cilt ve kalp kaldırılması sonra akciğerler gösterir. (E) Farinks kaldırılması embriyo sağlam akciğer ayrılmasına izin veren (F), fazladan faringeal doku ve yemek borusu koparılmış . E12.5 embriyonik akciğer sağlam trakea ve larinks ile disseke gösterilmiştir. (Cr) Kranial lob medial lob (Med), (Ca) Kaudal lob (Acc) Aksesuar lob (Le), Sol lob.
Şekil 2 FGF9 mezenşimin genişleme ve in vitro olarak yetiştirilen akciğer epitel dilatasyon neden olur. E12.5 akciğer (AC) FGF9 yokluğunda 48 saat için yetiştirilir. Dallanma artışı Not (DF) E12.5 akciğer FGF9 varlığı 48 saat için yetiştirilir. Dilatasyon gibi erken 24 saat sonra kültür epitel ve mezenşimin (E) Not. 48 saat sonra (F), epitel üzerindeki etkisi daha belirgindir. Ölçek çubuğu: AF 400 mikron 4.
Bu deneysel bir yaklaşım için tam metin protokolü mevcuttur Springer Protokolleri .
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Şaban Araştırma Enstitüsü doktora öncesi Ödülü (PMDM) tarafından desteklenen ve NIH RO1 HL75773 (DW).
References
- Alescio, T., Cassini, A. Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium. J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).
- Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. The molecular basis of lung morphogenesis. Mech Dev. 92, 55-81 (2000).
- Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight. J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).
- Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung. Dev Biol. 293, 77-89 (2006).
- Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
- Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures. Cell Differ. 24, 105-117 (1988).
- Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy. Dev Biol. 158, 555-559 (1993).
