Dechorionation av medaka Embryon och celltransplantation för generering av chimärer

Summary

På grund av den hårda chorion och mjuka embryon, manipulation av medaka embryon är mer engagerade än i zebrafisk. Denna video visar steg-för-steg-procedurer för hur man manipulerar medaka embryon, inklusive dechorionation, montering i agaros för avbildning och celltransplantation för framställning av chimärer. Dessa förfaranden är nödvändiga att använda medaka och zebrafisk i ett laboratorium för att dra full nytta av sina kompletterande funktioner för den genetiska dissekering av ryggradsdjur genomet funktioner.

Abstract

Medaka är ett litet äggläggande sötvattensfisk som tillåter både genetiska och embryologiska analyser och är en av de tre ryggradsdjur modell organismer i vilka arvsmassan hela fenotyp driven mutant skärmar genomfördes ^1. Avvikelse av funktionell överlappning av gener mellan medaka och zebrafisk möjliggör identifiering av nya fenotyper som är oidentifierbara i en enda art ^2, vilket medaka och zebrafisk är kompletterande för genetisk dissektion av ryggradsdjur genomet fungerar. Manipulering av medaka embryon, som dechorionation, montering embryon för avbildning och celltransplantation är viktiga rutiner för att arbeta med både medaka och zebrafisk i ett laboratorium. Celltransplantation undersöker cellen autonomi medaka mutationer. Chimärer genereras genom att transplantera märkta celler från givare embryon i omärkta mottagaren embryon. Donator celler kan transplanteras till specifika områden i mottagarens embryon utifrån öde kartorna ³ så att kloner från transplanterade celler kan integreras i vävnaden av intresse under utveckling. På grund av den hårda chorion och mjuka embryon, manipulation av medaka embryon är mer engagerade än i zebrafisk. I denna video visar vi detaljerade förfaranden för att manipulera medaka embryon.

Protocol

1. Utveckling av embryon

1. När de är lagda, är ägg klustrade på grund av fastsättning filament på chorion. Att låta embryona utvecklas normalt, är det nödvändigt att skilja mellan ägg. Trassel och skär fastsättning filament genom att hålla den bifogade filen filament med två pincett.
2. Efter unclustering är ägg separerade från avföring och alger och överföras till färskt embryo medelstora högst täthet av 40 ägg per 6cm petriskål.
3. Medaka embryon utvecklas något långsammare än zebrafisk vid 27 ° C. Tidpunkten för kläckning är olika mellan de två arterna, medaka embryon kläcks från chorion i 7 dagar och omedelbart börja att simma och äta, medan zebrafisk embryon kläcks i 2 dagar men börja simma och äta i 5-6 dagar. Utveckling av medaka är iscensatt enligt Iwamatsu iscensättning ^4.
4. Utvecklingen av medaka embryon kan enkelt anpassas till experimentella planer genom att välja lämplig temperatur. Utveckling av medaka embryon kan stoppas vid 4 ° C i början av utvecklingen. Efter steg 24 när hjärtat slå startar kan utvecklingen bromsas med hjälp av en lägsta temperatur på 18 ° C.
5. Tidpunkten för utseende av organ / vävnader är något annorlunda i medaka jämfört med zebrafisk sker dvs medaka somitogenesis efter debuten av hjärnans utveckling medan det i zebrafisk somitegenesis föregår hjärnans utveckling.

2. Ta bort chorion

Den chorion av medaka består av två skyddande lager med en hård inre skikt och en mjuk utsida. Således är en två-stegs proteas behandling anställa pronase och kläckning enzym nödvändigt att undanröja detta chorion.

När dechorionated, embryon bör hållas i 1X BSS. Semi-sterila förhållanden kommer att öka framgångsrika kultur dechorionated embryon, särskilt när längre perioder av observation krävs. Dessa inkluderar användning av sterila lösningar (t.ex. steriliseras 1X BSS med antibiotika) och verktyg steriliseras med 70% etanol följt av sköljning med 1X BSS.

Som dechorionated medaka embryon är mjukare och skörare än dechorionated zebrafisk embryon, måste extra försiktighet vidtas för att säkerställa att de inte kontakt med luft eller bubblor i pipetten, eftersom detta kommer att leda till omedelbar kollaps. För att säkerställa minimal skada på embryon bör en bred öppning värme polerat glaspipett med pipett pump användas för överföring av embryon och en hår slinga bör utnyttjas för att orientera embryon för observation. Icke-häftande Petriskålarna bör användas för att förhindra embryon från att fästa vid ytor.

1. Innan dechorionation det bör kontrolleras att de ägg som är tillräckligt varit åtskilda och rengöras upp.
2. Eftersom både pronase och enzymer kläckning är proteinaser, bör de hållas på is och minimera exponering av embryon för dessa enzymer.
3. Överföring ägg till sandpapper (P2000 kornstorlek, vattentät) placeras i locket på en 9cm petriskål. Ta bort överflödig medium men säkerställa en tillräcklig volym kvar för att förhindra uttorkning av embryon.
4. Rulla försiktigt embryon för runt 45-60 sekunder för att ta bort några av utsidan hår och lätt poäng ytan av chorion (Figur 1). Överför embryon tillbaka till original petriskål och undersöka.
   
   När rullande embryon på sandpapper använda pekfingret, tillämpa minimala tryck och hålla fingret parallell med ytan av sandpapper. Rulla inte mer än 5-7 embryon på en gång. Denna försiktighetsåtgärd kommer att minimera risken för krossning embryon under varandra.
   
   
5. Byt ägg medium i skålen med 20mg/ml pronase och embryon inkubera i 40-60 minuter vid 27 ° C.
   
   Se till att embryon tillräckligt täcks genom pronase och ett lock finns på skålen. Oanvända pronase bör hållas på is under detta steg för att minimera själva matsmältningen och kan återanvändas tills aktiviteten går förlorad (ca 1-2 veckor).
   
   
6. Återställ pronase för återanvändning och embryon tvätta 5X i embryot medellång till avlägsna spår av pronase eftersom detta kommer att inaktivera kläckningen enzymet ska läggas till.
7. Ta bort embryot medium och embryon täck med kläckningen enzym, se embryon sitta som en monolager i skålen.
   
   Om äggen sitter ovanpå varandra i skålen, kommer de på botten krossas som chorion löser sig. Förvara oanvända kläckning enzym på is.
   
   
8. Inkubera embryon vid 27 ° C och efter 15 minuter regelbundet kontrollera hur kläckningen med ett stereomikroskop.
   
   Det kommer att se att ett antal lunar krater-liknande hål börja visas i det inre lagret av chorion, som snart löser upp efter detta lämnar den mjuka yttre lagret av chorion lätt avlägsnas manually. Hela processen för kläckning kan ta 15-60 minuter.
   
   
9. Så snart embryon kommer ut från chorion, överföra embryon till en petriskål med 1X BSS.
   
   Se till att inte överföra kläckning enzym till 1X BSS genom att trycka på toppen av pipetten på ytan av BSS låta de embryon som försiktigt rulla ut.
   
   
10. När alla embryon överförs från kläckning enzym, göra en slutlig överföring till en annan ny maträtt 1X BSS.
    
    Detta säkerställer embryon som inte utsätts för några rester av kläckningen enzym, eftersom det skadar utsätts embryon. Väl i denna sista maträtt några embryon fortfarande innehar det yttre lagret av chorion kan manuellt frigjorts med steriliserade mikro-pincetter under stereomikroskop.
    
    Om embryon behöver utvecklas efter dechorionation, bör penicillin / streptomycin läggas till BSS för att förhindra bakterietillväxt.
    
    

Figur 1. Jämförelse mellan rullade och rullade ut embryon under dechorionation. Observera hur de rullade embryon i panelen B saknar hår ses på utrullade embryon i panelen A.

3. Montering dechorionated embryon

Agarosen bädda är användbart för längre perioder av imaging (t.ex. tidsförlopp imaging) för levande embryon samt för detaljerade observationer av fast embryon. Under gastrulation och början organogenesen (stadium 14 till stadium 28), medaka embryon uppvisar vågor av rytmiska kontraktil rörelser över periderm, en vävnad skikt som täcker både det växande embryot och äggula ^5. Embryon behandlas med 3,5 mm 1-heptanol att stoppa kontraktila rörelser ^6.

För att stoppa flödet av embryon efter etapp 28 (64hpf), embryon är bedövad genom att tillsätta droppar trikainmesilat (TMS) innan inbäddning. TMS är också till i agaros (lägg bara en minimal mängd, denna dos måste optimeras, cirka en 1:25 spädning).

1. Tina en liten mängd 3% låg gelbildande temperatur agaros (i 1X BSS) genom upphettning till 37 ° C och hålls kvar vid denna temperatur.
2. Följande steg måste genomföras snabbt för att säkerställa att agarosen inte stelna innan orientera embryot. Med hjälp av en bred öppning överföra glaspipett nog smälta agarosen att fylla locket depressionen ett Eppendorf-rör.
3. Överför en dechorionated embryo till den gemensamma jordbrukspolitiken depression minimera överföring BSS med embryot. Omedelbart upptag agarosen och embryo ur korken depression och överför till en petriskål kultur kammare.
   
   En 3,5 cm petriskål med ett glasfönster i botten används. För avbildning med ett inverterat mikroskop, embryon är inriktade kroppen nedåt och placeras nära skyddsglas. För avbildning med en upprätt mikroskop, är tjockleken på agarosen minimeras.
   
   
4. Överför 3,5 cm petriskål i en 14cm diameter petriskål med is och vatten (vatten är fylld till ungefär 1 / 3 Totalt djup på stort fat). Samtidigt håller kammaren nedåt på botten av 14cm petriskål, använda en hår slinga för att försiktigt orientera embryot som önskas i den smälta agarosen och håll embryot tills agarosen stelnar genom att försiktigt höja och sänka den mindre skålen till sitt ursprungliga läge i iskallt vatten.

4. Celltransplantation i medaka embryon

Målet med detta förfarande är att avgöra om genen av intresse agerar cell-självständigt (inom en cell) eller icke cell-självständigt (mellan cellerna).

Donator celler kan märkas med ett spårämne färgämne som Rhodamine-dextran före transplantation (som beskrivs i den medföljande JUPITER-protokollet "mikroinjektion Av medaka embryon) eller en transgen stam med GFP uttryck kan utnyttjas, så att transplantation bedömning. En kombination av båda märkning tekniker är ofta användbart att övervinna auto-fluorescens som kan bli aktuella. För tidsförlopp studier efter transplantation, är GFP uttryck särskilt användbart.

Använd en bred öppning glaspipett med pipett pumpen under hela detta förfarande och sterilisera alla verktyg (inklusive bilder) i förväg med 70% EtOH följt av noggrann sköljning med steril 1X BSS. Mottagare embryon utvecklas vanligen till omkring scenen 12 eftersom detta kan diskriminering av den ventrala och dorsala stolpar när de utför transplantation.

1. Påbörja dechorionating embryon 1,5 timmar före transplantationen och setup injektion apparater under enzym inkubationer.
2. Placera en bild hålighet mikroskop i en 9cm diameter petriskål. Tillsätt en liten mängd på 3% metylcellulosa till mitten av hålrummet bilden med en steril pipett spets och sprids tunt.
3. Torr metylcellulosa i ca 1-2 minuter.
4. Tillsätt 350μl sterilt 1X BSS att fylla bilden depression.
5. Överför en givare embryo och upp till fyra embryon mottagaren till bilden med hjälp av ett glas pipett.
6. Orientera embryon med hjälp av en hår slinga så BLASTODERM av embryot är vänt uppåt.
   
   Embryon kan lutade sig mot varandra för att ytterligare öka stabiliteten.
   
   
7. Försiktigt in mikro-nålen i givare BLASTODERM och långsamt upptag 10-20 celler.
8. Försiktigt in nålen i önskat område av mottagare embryo BLASTODERM och utvisa cellerna långsamt. Stor försiktighet bör iakttas när du sätter i cellerna i mottagaren BLASTODERM för att inte störa cell-gulesäcken gränsen eftersom detta kommer att leda till döden av embryot.
9. Häll steriliserade 1X BSS i petriskål.
   
   Häll försiktigt BSS i skålen så nära sidan av skålen som möjligt för att inte störa embryon. Häll aldrig BSS direkt på embryon och lägga tillräckligt BSS så att bilden och embryon är nedsänkta.
   
   
10. Tillsätt 100μl av penicillin / streptomycin till skålen och locket. Töm skålen en 27 ° C inkubator för att tillåta normal utveckling.
11. Embryon kan regelbundet observeras som önskat. När du använder transplantation för att utföra vinna-of-funktionen och / eller fenotyp experiment räddning, kan vissa morfologiska observerade förändringarna bero på att effekterna av transplantation. Således flera transplantationer är nödvändiga. Efter 2-3 dagar bör melanophores finnas på gulesäcken, huvud, ögon och bål. Om sådan finns på transplanterats embryon sedan en framgångsrik chimär har troligen tagits fram (Figur 3).

Om det behövs, genotyp donator embryo (er) genom att övergå till PCR-rör (er) som innehåller 25μl av 20mg/ml proteinas K. Inkubera vid 55 ° C i 4 timmar följt av 10 minuter vid 94 ° C och utföra PCR.

5. Representativa resultat

Figur 2. Exempel ställning en agaros-inbäddad embryo. Främre visas till höger och vyn är rygg. Panel B: endotelceller kan ses på vardera sidan av embryots kropp och är märkta med GFP drivs av Fli arrangören.

Figur 3. Bilder av efter transplantation embryon. Bild A visar en donator och mottagare embryo omedelbart efter transplantation. Givaren embryot visas till höger med en helt röd BLASTODERM (pil). Mottagaren embryot visas till vänster och är lätt identifieras av den lilla massa röda transplanterade cellerna syns i BLASTODERM (pilspets). Bild B visar två mottagare embryon ca 7 timmar efter transplantation (inkuberas vid 27 ° C). Lägg märke till de transplanterade cellerna har migrerat från platsen för transplantation och är nu utspridda över hela BLASTODERM (pilar). Bild C visar en mottagare embryo i st.29 (ca 74hpf). Notera pigmentering i ögat och förekomsten av melanophores i bagageutrymmet och hjärnan region (pilar). Den Rhodamine-märkta celler kan ses som kolonisera många av de embryonala strukturer som visar den framgångsrika produktionen av en chimär.

Discussion

I denna video visar vi hur du dechorionate och utföra cellen transplanataion på medaka embryon. Detta är en kraftfull teknik för att producera chimär embryon för studier av genen / proteiners funktion under utvecklingen, samt för att belysa autonomin hos genen / protein i fråga. Medaka är ett användbart ryggradsdjur modellsystem för denna teknik på grund av väletablerade öde kartor och deras öppenhet utlåning dem väl i vivo realtid avbildning. Transplantation kan kombineras med mikroinjektion (som beskrivs i den medföljande JUPITER-protokollet "mikroinjektion Av medaka Embryon ') så att beteendet hos transplanterade cellerna lätt kan observeras.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Embryo medium	Reagent	Made in-house	N/A	200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.)
Micro-dissecting forceps	Tools	55 INOX A.DUMONT&FILS	N/A	Very sharp fine tips for removal of chorion.
Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size	Tools	Hermes Abrasives Ltd.	N/A	Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.
3% methylcellulose	Reagent	Sigma	M 0512	High viscosity for holding embryos in place during transplantation.
1X BSS	Reagent	Made in-house	N/A	20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO4.7H2O, 4g CaCl2.2H2O, and 10mg Phenol Red in 1L MilliQ water and autoclave; 500mM Hepes in MilliQ water autoclaved. Add 25ml 20XBSS and 15ml 500ml Hepes pH7.0, fill up to 500ml and filter sterilize before use.
Penicillin-streptomycin	Reagent	Gibco	15140-122	Added to BSS when incubating dechorionated embryos.
Pronase	Reagent	Calbiochem	53702	For dechorionation.
Hatching enzyme	Reagent	Made in-house	N/A	For dechorionation.
Tricaine mesilate (TMS)	Reagent	Sigma	A-5040	400mg tricaine in 97.9ml distilled water and 2.1ml 1M Tris, pH adjusted to 7; 4.2ml of this solution in 100ml clean tank water.
3% ultra-low gelling temp. agarose	Reagent	Sigma	A-2576	Type IX-A. Used during embedding of embryos for observation.
Petri dish culture chamber	Tool	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	11-004-008	Iwaki glass base dish 35mm with 12mm window. Used during embedding of embryos for observation.
Micromanipulator	Equipment	Narishige	N/A	Model MN151. For removal and insertion of cells during transplantation.
Borosilicate glass capillaries	Tool	Harvard Apparatus	GC100-10T	For making transplantation needles.
Flaming/Brown micropipette puller	Equipment	Sutter Instrument Co.	Model P-97	For making transplantation needles.