Summary
Debido a que el corion duro y blando de embriones, la manipulación de embriones medaka es más complicado que en el pez cebra. Este video muestra paso a paso los procedimientos para la forma de manipular embriones medaka, incluyendo dechorionation, montaje de agarosa para la imagen y el trasplante de células para la producción de quimeras. Estos procedimientos son esenciales para el uso medaka y pez cebra en un laboratorio para sacar el máximo provecho de sus características complementarias para la disección genética de las funciones de genoma de los vertebrados.
Abstract
Medaka es una pequeña puesta de huevos de peces de agua dulce que permite a los análisis genéticos y embriológicos y es uno de los tres organismos modelo vertebrado en el que todo el genoma impulsado fenotipo mutante pantallas se llevaron a cabo 1. Divergencia de superposición de funciones de los genes relacionados entre medaka y pez cebra permite la identificación de los fenotipos de la novela que no son identificables en una sola especie 2, por lo tanto medaka y pez cebra son complementarios para la disección genética de las funciones genoma de los vertebrados. Manipulación de embriones medaka, como dechorionation, los embriones de montaje de imagen y el trasplante de células, son procedimientos claves para trabajar en ambos medaka y pez cebra en un laboratorio. El trasplante de células examina la autonomía de las mutaciones de células medaka. Las quimeras son generados mediante el trasplante de células marcadas a partir de embriones de donantes en los embriones receptores sin etiquetar. Las células del donante se pueden transplantar a zonas específicas de los embriones receptores basados en el destino mapas 3 de modo que los clones de las células trasplantadas se pueden integrar en el tejido de interés durante el desarrollo. Debido a que el corion duro y blando de embriones, la manipulación de embriones medaka es más complicado que en el pez cebra. En este vídeo, se muestran los procedimientos detallados para manipular embriones medaka.
Protocol
1. Desarrollo de los embriones
- Cuando se establecen, los huevos están agrupados por filamentos de fijación en el corion. Para permitir que los embriones se desarrollan normalmente, es necesario separar los huevos. Maraña y cortar los filamentos apego mediante la celebración de los filamentos de unión con dos pinzas.
- Vez deshecho el clúster, los huevos se separan de las heces y las algas y la transfieren a un medio de embriones frescos, con una densidad máxima de 40 huevos por placa de Petri de 6 cm.
- Embriones medaka desarrollo algo más lento que el pez cebra a 27 ° C. El tiempo de incubación es diferente entre las dos especies; embriones medaka escotilla del corion en 7 días y de inmediato empezar a nadar y comer, mientras que embriones de pez cebra se incuban en 2 días, pero empezar a nadar y comer en 5-6 días. Desarrollo de medaka se clasifican de acuerdo a cuatro puesta en escena de Iwamatsu.
- El desarrollo de los embriones medaka puede ser convenientemente ajustada a los planes experimentales mediante la selección de la temperatura adecuada. Desarrollo de los embriones medaka se puede detener a 4 ° C en el desarrollo temprano. Después de la etapa 24, cuando empieza a corazón latiendo, el desarrollo puede ser frenado con una temperatura mínima de 18 ° C.
- El momento de aparición de órganos / tejidos es ligeramente diferente en medaka comparación con el pez cebra, es decir, en somitogenesis medaka se produce después del inicio del desarrollo del cerebro, mientras que en el pez cebra somitegenesis precede el desarrollo del cerebro.
2. Extracción del corion
El corion de medaka se compone de dos capas de protección con una capa dura interna y una superficie exterior suave. Por lo tanto, un tratamiento de la proteasa en dos pasos empleando la enzima pronasa y la eclosión es necesario eliminar esta corion.
Una vez dechorionated, los embriones deben mantenerse en 1X BSS. Semi-estériles condiciones mejorarán el éxito del cultivo de embriones dechorionated, especialmente a partir de períodos de observación son necesarios. Estos incluyen el uso de soluciones estériles (por ejemplo, esterilizados 1X BSS con antibióticos) y herramientas esterilizadas con etanol al 70% seguido de un enjuague con 1X BSS.
Como dechorionated embriones medaka son más suaves y más frágiles que los embriones de pez cebra dechorionated, cuidado se debe tomar para asegurarse de que no entren en contacto con el aire o burbujas en la pipeta, ya que esto provocaría un colapso inmediato. Para asegurar un mínimo daño a los embriones, una pipeta de calor de boca ancha de vidrio pulido con una bomba de pipeta se debe utilizar para la transferencia de embriones y un lazo del pelo deben ser utilizados para orientar los embriones para la observación. No adherente placas de Petri se deben utilizar para evitar que los embriones se adhieran a las superficies.
- Antes de dechorionation se debe comprobar que los huevos han sido lo suficientemente separados y limpiados.
- Dado que tanto pronasa y enzimas proteasas para incubar, deben mantenerse en hielo y minimizar la exposición de los embriones de estas enzimas.
- La transferencia de los huevos de papel de lija (P2000 tamaño de grano, resistente al agua) colocado en la tapa de una caja de Petri de 9 cm. Retire el exceso de medio, sino garantizar un volumen suficiente como para evitar que restos de secado de los embriones.
- Suavemente gire en torno a los embriones de 45 a 60 segundos para eliminar algunos de los pelos y la superficie externa ligeramente marcas en la superficie del corion (Figura 1). La transferencia de embriones back to original placa de Petri y examinar.
Cuando los embriones que rueda sobre el papel de lija usar el dedo índice, aplicando una presión mínima y manteniendo los dedos en paralelo a la superficie de papel de lija. No ruede más de 5.7 embriones a la vez. Esta precaución reducirá al mínimo el riesgo de aplastamiento de los embriones por debajo de la otra. - Vuelva a colocar medio huevo en un plato con pronasa 20mg/ml y los embriones se incuban durante 40-60 minutos a 27 ° C.
Asegúrese de que los embriones son suficientemente cubierto por una tapa pronasa y está presente en el plato. Pronasa no utilizada debe ser mantenido en hielo durante este paso para evitar la auto-digestión y se puede reutilizar hasta que la actividad se pierde (aproximadamente 1-2 semanas). - Recuperar para su reutilización y pronasa embriones lavar 5 veces en medio de embriones para eliminar los restos de pronasa, ya que esto inactivar la enzima para incubar añadió.
- Quitar medio de embriones y embriones de la cubierta con la enzima de la eclosión, garantizando los embriones se siente como una monocapa en el plato.
Si los huevos se sientan encima de uno al otro en el plato, los de abajo serán aplastados como el corion se disuelve. Mantenga las enzimas utilizadas para incubar en hielo. - Incubar los embriones a los 27 ° C y después de 15 minutos compruebe periódicamente el avance de la eclosión usando un microscopio estereoscópico.
Se verá que una serie de cráter lunar-como los agujeros comienzan a aparecer en la capa interna del corion, que pronto se disuelve después de este salir de la suave capa externa del corion quitar fácilmente manually. Todo el proceso de incubación puede tomar 15-60 minutos. - Tan pronto como los embriones salen del corion, la transferencia de embriones a una placa de Petri que contiene 1X BSS.
Asegúrese de no transferir la enzima para incubar a la BSS 1X tocando la punta de la pipeta sobre la superficie de la BSS permite que los embriones a rodar con cuidado. - Una vez que todos los embriones son transferidos de la enzima de la eclosión, hacer una transferencia definitiva a otro plato fresco de 1X BSS.
Esto asegura que los embriones no están expuestos a los restos de la enzima de la eclosión, ya que podría dañar los embriones expuestos. Una vez en el plato final, los embriones siguen poseyendo la capa externa del corion puede ser liberado manualmente utilizando unas pinzas esterilizadas micro-bajo el microscopio estereoscópico.
Si los embriones deben ser desarrollados dechorionation siguiente, a la penicilina / estreptomicina, debe añadirse a la SEV para prevenir el crecimiento bacteriano.
Figura 1. Comparación de los embriones durante el enrollado y desenrollado dechorionation. Observe cómo los embriones rodó en el panel B carecen de los pelos se ve en los embriones desenrolla en el panel A.
3. Montaje de embriones dechorionated
Incorporación de agarosa es útil para períodos más largos de la imagen (por ejemplo, time-lapse de imágenes) de embriones vivos, así como de las observaciones detalladas de embriones fijo. Durante la gastrulación y organogénesis temprana (etapa 14 a la etapa 28), los embriones medaka exhiben ondas rítmicas de los movimientos de contracción a través de la peridermis, una capa de tejido que cubre tanto el desarrollo del embrión y la yema de huevo 5. Los embriones son tratados con 3,5 mm 1-heptanol de detener los movimientos de contracción 6.
Para detener el movimiento de embriones después de la etapa 28 (64hpf), los embriones son anestesiados mediante la adición de gotas de tricaína mesilato (TMS) antes de la incrustación. TMS también se agrega a la agarosa (añadir una cantidad mínima, esta dosis debe ser optimizado, de aproximadamente una dilución de 1:25).
- Descongelar una cantidad pequeña de baja temperatura de gelificación del 3% de agarosa (en 1X BSS) por calentamiento a 37 º C y mantener a esta temperatura.
- Los siguientes pasos deben llevarse a cabo con rapidez para garantizar que la agarosa no se solidifique antes de orientar el embrión. Mediante una transferencia de vidrio de boca ancha pipeta de agarosa fundida suficiente para llenar la tapa de la depresión de un tubo de Eppendorf.
- La transferencia de un embrión dechorionated a la depresión tapa minimizar llevar más de BSS con el embrión. Inmediatamente la absorción de la agarosa y el embrión de la depresión de la tapa y la transferencia a una cámara de cultivo placa de Petri.
Una placa de Petri de 3,5 cm con una ventana de cristal en la parte inferior se utiliza. Para obtener imágenes mediante un microscopio invertido, los embriones son orientados hacia abajo, el cuerpo y se coloca cerca de la cubierta de vidrio. Para obtener imágenes con un microscopio vertical, el espesor de agarosa se reduce al mínimo. - La transferencia de la placa de Petri de 3,5 cm de diámetro en una placa de Petri que contiene 14 cm de hielo y agua (lleno de agua a la profundidad de aproximadamente 1 / 3 del total de plato grande). Mientras mantiene la cámara firmemente en la parte inferior de la placa de Petri 14 cm, utilice un bucle de cabello suavemente para orientar el embrión como se desee en la agarosa fundida y retener el embrión hasta que la agarosa solidifica suavemente subiendo y bajando el plato más pequeño a su posición original en el agua helada.
4. El trasplante de células de embriones medaka
El objetivo de este procedimiento es determinar si el gen de interés actúa en células de manera autónoma (dentro de una célula) o no de células de forma autónoma (entre las células).
Las células del donante puede ser etiquetada con un tinte trazador como rodamina dextrano antes del trasplante (como se describe en 'La microinyección de embriones de medaka "el protocolo que acompaña Jove) o una cepa transgénica con la expresión de GFP se puede utilizar, permitiendo una evaluación del trasplante. Una combinación de ambas técnicas de etiquetado a menudo es útil para superar la auto-fluorescencia que se pueden encontrar. Para los estudios de lapso de tiempo después del trasplante, la expresión de GFP es particularmente útil.
Use una pipeta de vidrio de boca ancha con una bomba de pipeta a través de este procedimiento y esterilizar todas las herramientas (incluyendo diapositivas) de antemano con EtOH al 70% seguido por un enjuague con agua estéril BSS 1X. Receptor embriones se desarrollan normalmente en torno a la 12 ª etapa, ya que permite la discriminación de los polos ventral y dorsal al llevar a cabo el trasplante.
- Comenzará dechorionating embriones 1,5 horas antes del trasplante y aparatos de inyección de configuración durante la incubación enzimática.
- Colocar un portaobjetos de microscopio cavidad en un diámetro de 9 cm de placa de Petri. Agregue una pequeña cantidad del 3% de metilcelulosa en el centro de la diapositiva cavidad con una punta de pipeta estériles y diluirse.
- Metilcelulosa en seco durante unos 1-2 minutos.
- Agregar 350μl de BSS estéril 1X para llenar la depresión de diapositivas.
- La transferencia de un embrión donante y un máximo de cuatro embriones receptores a la diapositiva utilizando una pipeta de vidrio.
- Embriones orientarse mediante un bucle de cabello por lo que el blastodermo del embrión es hacia arriba.
Los embriones se pueden inclinó unos contra otros para aumentar la estabilidad adicional. - Inserte suavemente la micro-aguja en blastodermo donantes y poco a poco la absorción de 10-20 células.
- Suavemente inserte la aguja en el área requerida de blastodermo receptores embrión y expulsar a las células lentamente. Gran cuidado se debe tomar cuando se inserta en las células del blastodermo beneficiarias a fin de no interrumpir las células de la yema de los límites del saco, ya que puede provocar la muerte del embrión.
- Vierta esterilizados 1X BSS en la placa de Petri.
Vierta cuidadosamente la BSS en el plato lo más cerca posible del lado de la antena como sea posible a fin de no interrumpir los embriones. Nunca vierta el BSS directamente sobre los embriones y añadir suficiente BSS de forma que la diapositiva y los embriones se encuentran inmersos. - Agregar 100μl de penicilina / estreptomicina al plato y la tapa. Con cuidado, llevar la cápsula a una incubadora de 27 ° C para permitir el desarrollo normal.
- Los embriones pueden ser observadas periódicamente como se desee. Cuando se utiliza para llevar a cabo el trasplante de ganancia de función y / o experimentos fenotipo de rescate, algunos de los cambios morfológicos observados podrían deberse a los efectos del trasplante. Así, los trasplantes múltiples son necesarios. Después de 2-3 días, melanóforos debe estar presente en el saco vitelino, cabeza, ojos y tronco. Si está presente en los embriones trasplantados luego un éxito quimera ha sido probablemente producida (Figura 3).
Si es necesario, el genotipo del embrión donante (s) por la transferencia de PCR de tubo (s) con 25μl de 20mg/ml proteinasa K. Se incuba a 55 ° C durante 4 horas seguido de 10 minutos a 94 ° C y llevar a cabo la PCR.
5. Los resultados representativos
Figura 2. Posición Ejemplo de un embrión de agarosa embebidos. Anterior se muestra a la derecha y la vista es dorsal. Grupo B: las células endoteliales se puede ver a ambos lados del cuerpo del embrión y se etiquetan con las buenas prácticas agrarias impulsadas por el promotor fli.
Figura 3. Imágenes de los embriones después del trasplante. La imagen A muestra un embrión de donante y el receptor inmediato post-trasplante. El embrión donante es de la derecha con un blastodermo completamente rojo (flecha). El embrión destinatario se muestra a la izquierda y se identifica fácilmente por la pequeña masa de rojo las células trasplantadas visible en el blastodermo (cabeza de flecha). La imagen B muestra dos embriones receptores de aproximadamente 7 horas post-trasplante (se incuba a 27 ° C). Observe que las células trasplantadas migraron desde el sitio del trasplante y ahora están dispersos por todo el blastodermo (flechas). La imagen C muestra un embrión receptor en st.29 (aproximadamente 74hpf). Tenga en cuenta la pigmentación en los ojos y la presencia de melanóforos en la región del tronco y el cerebro (flechas). Las células rodamina-etiquetados puede ser visto como la colonización muchas de las estructuras embrionarias que indica el éxito de la producción de una quimera.
Discussion
En este video se muestra cómo dechorionate y llevar a cabo transplanataion celular en embriones medaka. Esta es una poderosa técnica para producir embriones quiméricos para el estudio de la función de genes / proteínas durante el desarrollo, así como para aclarar la autonomía de los genes / proteínas en cuestión. Medaka son un sistema de vertebrados modelo útil para esta técnica debido a los mapas de destino bien establecido y sus préstamos a la transparencia y en vivo imágenes en tiempo real. El trasplante puede ser combinado con microinyección (como se describe en 'La microinyección de embriones medaka "el protocolo que acompaña Jove) para que el comportamiento de las células trasplantadas se pueden observar fácilmente.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por una beca de la MRC al señor FS.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo medium | Reagent | Made in-house | N/A | 200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.) |
| Micro-dissecting forceps | Tools | 55 INOX A.DUMONT&FILS | N/A | Very sharp fine tips for removal of chorion. |
| Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size | Tools | Hermes Abrasives Ltd. | N/A | Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions. |
| 3% methylcellulose | Reagent | Sigma | M 0512 | High viscosity for holding embryos in place during transplantation. |
| 1X BSS | Reagent | Made in-house | N/A | 20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO4.7H2O, 4g CaCl2.2H2O, and 10mg Phenol Red in 1L MilliQ water and autoclave; 500mM Hepes in MilliQ water autoclaved. Add 25ml 20XBSS and 15ml 500ml Hepes pH7.0, fill up to 500ml and filter sterilize before use. |
| Penicillin-streptomycin | Reagent | Gibco | 15140-122 | Added to BSS when incubating dechorionated embryos. |
| Pronase | Reagent | Calbiochem | 53702 | For dechorionation. |
| Hatching enzyme | Reagent | Made in-house | N/A | For dechorionation. |
| Tricaine mesilate (TMS) | Reagent | Sigma | A-5040 | 400mg tricaine in 97.9ml distilled water and 2.1ml 1M Tris, pH adjusted to 7; 4.2ml of this solution in 100ml clean tank water. |
| 3% ultra-low gelling temp. agarose | Reagent | Sigma | A-2576 | Type IX-A. Used during embedding of embryos for observation. |
| Petri dish culture chamber | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 11-004-008 | Iwaki glass base dish 35mm with 12mm window. Used during embedding of embryos for observation. |
| Micromanipulator | Equipment | Narishige | N/A | Model MN151. For removal and insertion of cells during transplantation. |
| Borosilicate glass capillaries | Tool | Harvard Apparatus | GC100-10T | For making transplantation needles. |
| Flaming/Brown micropipette puller | Equipment | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | For making transplantation needles. |
References
- Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes. Mech Dev. 121, 647-658 (2004).
- Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study. Mech Dev. 121, 629-6237 (2004).
- Hirose, Y., Varga, Z. M., Kondoh, H., Furutani-Seiki, M. Single cell lineage and regionalization of cell populations during Medaka neurulation. Development. 131, 2553-2563 (2004).
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- Cope, J., Fluck, R., Nicklas, L., Plumhoff, L. A., Sincock, S. The stellate layer and rhythmic contractions of the Oryzias latipes embryo. J Exp Zool. 254, 270-275 (1990).
- Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization. J Vis Exp. , (2009).
