Dechorionation van Medaka Embryo's en Cell Transplantation voor de generatie van chimaeren

Summary

Door de harde chorion en zachte embryo's, manipulatie van embryo's medaka is meer betrokken dan in de zebravis. Deze video laat stap-voor-stap procedures voor hoe medaka embryo's te manipuleren, waaronder dechorionation, montage in agarose voor de beeldvorming en de cel transplantatie voor de productie van hersenspinsels. Deze procedures zijn essentieel voor medaka en zebravis gebruik in een laboratorium ten volle te profiteren van hun complementaire eigenschappen te nemen voor de genetische dissectie van gewervelde genoom functies.

Abstract

Medaka is een klein ei-leggen zoetwatervis dat zowel genetische en embryologische analyses mogelijk maakt en is een van de drie gewervelde model organismen waarvan het genoom-brede fenotype aangedreven mutant schermen werden uitgevoerd ^1. Divergentie van de functionele overlap van gerelateerde genen tussen medaka en zebravis maakt identificatie van nieuwe fenotypen die niet identificeerbaar zijn in een enkele soort ^twee, dus medaka en zebravissen zijn complementair voor genetische dissectie van de gewervelde genoom functies. Manipulatie van medaka embryo's, zoals dechorionation, montage embryo's voor imaging-en celtransplantatie, zijn de belangrijkste procedures op beide medaka en zebravis werken in een laboratorium. Celtransplantatie onderzoekt cel autonomie van medaka mutaties. Hersenspinsels worden gegenereerd door het transplanteren van gelabelde cellen van donor embryo's in niet-gelabelde ontvanger embryo's. Donor cellen kunnen worden getransplanteerd op specifieke gebieden van de ontvanger embryo's op basis van het lot kaarten ^3, zodat klonen van getransplanteerde cellen kunnen worden geïntegreerd in het weefsel van belang tijdens de ontwikkeling. Door de harde chorion en zachte embryo's, manipulatie van embryo's medaka is meer betrokken dan in de zebravis. In deze video laten we zien gedetailleerde procedures voor het medaka embryo's te manipuleren.

Protocol

1. Ontwikkeling van de embryo's

1. Als ze zijn gelegd, worden de eieren geclusterd vanwege de gehechtheid filamenten op het chorion. Te laten embryo's normaal ontwikkelen, is het noodzakelijk te scheiden eieren. Tangle en snijd bevestiging filamenten door houden de bijlage filamenten met twee tang.
2. Na unclustering, zijn eieren gescheiden van uitwerpselen en algen en overgebracht naar verse embryo medium bij een maximale dichtheid van 40 eieren per 6cm petrischaal.
3. Medaka embryo's te ontwikkelen iets langzamer dan de zebravis bij 27 ° C. De timing van het uitbroeden is verschillend tussen de twee soorten; medaka embryo luik van het chorion in 7 dagen en direct aan de slag om te zwemmen en te eten, terwijl de zebravis embryo's uitkomen in 2 dagen, maar beginnen om te zwemmen en te eten in 5-6 dagen. De ontwikkeling van medaka is georganiseerd volgens de enscenering Iwamatsu's ^4.
4. De ontwikkeling van medaka embryo's kunnen gemakkelijk worden aangepast aan de experimentele plannen door het selecteren van de juiste temperatuur. Ontwikkeling van medaka embryo's kan worden gestopt bij 4 ° C in de vroege ontwikkeling. Na etappe 24 als hartslag begint, kan de ontwikkeling worden vertraagd met behulp van een minimum temperatuur van 18 ° C.
5. De timing van het verschijnen van organen / weefsels is iets anders in medaka in vergelijking met zebravissen, dat wil zeggen in medaka somitogenesis optreedt na het begin van de ontwikkeling van de hersenen terwijl in zebravis somitegenesis vooraf ontwikkeling van de hersenen.

2. Het verwijderen van de chorion

Het chorion van medaka bestaat uit twee beschermende lagen met een harde binnenste laag en een zachte buitenkant. Zo, een twee-staps protease behandeling in dienst pronase en broedeieren enzym is nodig om deze verwijderen chorion.

Eenmaal dechorionated, embryo's moet worden bewaard in 1X BSS. Semi-steriele omstandigheden zal de succesvolle cultuur van dechorionated embryo's, vooral als langere periodes van observatie nodig zijn. Deze omvatten het gebruik van steriele oplossingen (bijv. gesteriliseerd 1x BSS met antibiotica) en hulpmiddelen gesteriliseerd met 70% ethanol gevolgd door spoelen met 1X BSS.

Als dechorionated medaka embryo's worden zachter en kwetsbaarder dan dechorionated zebravis embryo's, moet extra zorg worden genomen om te garanderen dat ze niet de lucht of bellen in de pipet contact, omdat dit meteen instorten veroorzaken. Om ervoor te zorgen minimale schade aan embryo's, moet een grote mond warmte geslepen glazen pipet met een pipet pomp worden gebruikt voor het overbrengen van embryo's en een haar lus moet worden gebruikt om embryo's voor observatie oriënteren. Niet-klevende petrischaaltjes moeten worden gebruikt om embryo's te voorkomen die verbonden zijn aan oppervlakken.

1. Voorafgaand aan de dechorionation dient te worden gecontroleerd dat de eieren voldoende zijn gescheiden en gereinigd-up.
2. Aangezien zowel pronase en broedeieren enzymen proteïnasen, moeten ze worden bewaard op ijs en het minimaliseren van de blootstelling van embryo's voor deze enzymen.
3. Overdracht eieren schuurpapier (P2000 korrel, waterdicht) geplaatst in het deksel van een 9cm petrischaal. Verwijder overtollig medium, maar zorgen voor een voldoende volume blijft om uitdroging te voorkomen van embryo's.
4. Zachtjes rollen embryo's voor ongeveer 45-60 seconden tot enkele van de buitenkant haartjes te verwijderen en licht het oppervlak van het chorion (Figuur 1) score. Transfer terug naar de oorspronkelijke embryo's petrischaal en te onderzoeken.
   
   Bij het rollen embryo's op schuurpapier de wijsvinger te gebruiken, het toepassen van minimale druk en houden de vinger parallel aan het oppervlak van schuurpapier. Niet rollen meer dan 5-7 embryo's in een keer. Deze voorzorgsmaatregel wordt het risico van verbrijzeling embryo's onder elkaar.
   
   
5. Vervang ei medium in schotel met 20mg/ml pronase en incubeer embryo's voor 40-60 minuten bij 27 ° C.
   
   Zorg ervoor dat embryo's worden voldoende gedekt door pronase en een deksel aanwezig is op de schotel. Ongebruikte pronase worden bewaard op ijs tijdens deze stap zelf-vergisting te minimaliseren en kan worden hergebruikt totdat activiteit verloren (ongeveer 1-2 weken).
   
   
6. Recover pronase voor hergebruik en was embryo's 5X in embryo medium om sporen van pronase te verwijderen omdat dit het uitkomen enzym te inactiveren worden toegevoegd.
7. Verwijder de embryo medium en bedek embryo's met arceringen enzym, waardoor embryo's zitten als een monolaag in de schaal.
   
   Als de eieren zitten op de top van elkaar in de schotel, zullen deze aan de onderkant worden verpletterd als de chorion oplost. Bewaar ongebruikte uitkomen enzym op ijs.
   
   
8. Incubeer embryo's bij 27 ° C en na 15 minuten periodiek de voortgang van het uitbroeden met behulp van een stereomicroscoop.
   
   Het zal worden gezien dat een aantal van de maan krater-achtige gaten beginnen te verschijnen in de binnenste laag van het chorion, die al snel oplost na deze verlaten van de zachte buitenste laag van de chorion gemakkelijk verwijderd manually. Het hele proces van het uitkomen kan nemen 15-60 minuten.
   
   
9. Zodra embryo's afkomstig zijn uit het chorion, overdracht embryo's een petrischaal met 1X BSS.
   
   Zorg ervoor dat niet uitkomen enzym naar de 1X BSS door het aanraken van de punt van de pipet op het oppervlak van de BSS waardoor de embryo's om voorzichtig uitrollen.
   
   
10. Als alle embryo's worden overgebracht van het uitkomen enzym, een definitieve overplaatsing naar een andere verse schotel van 1X BSS.
    
    Dit zorgt voor embryo's zijn niet blootgesteld aan resten van het uitbroeden enzym, omdat dit schade aan blootgesteld embryo's. Eenmaal in dit laatste gerecht een embryo's nog steeds het bezit van de buitenste laag van de chorion kan handmatig worden bevrijd met behulp van gesteriliseerde micro-pincet onder de stereomicroscoop.
    
    Als embryo's moeten worden ontwikkeld na dechorionation, moet penicilline / streptomycine worden toegevoegd aan de BSS om bacteriële groei te voorkomen.
    
    

Figuur 1. Vergelijking van gewalst en uitgerold embryo's tijdens dechorionation. Observeer hoe de opgerolde embryo's in paneel B de haren te zien op de uitgerold embryo's in paneel A. gebrek aan

3. Montage dechorionated embryo's

Agarose inbedding is handig voor langere periodes van beeldvorming (bv. time-lapse imaging) voor levende embryo's en voor gedetailleerde observaties van vaste embryo's. Tijdens de gastrulatie en de vroege organogenese (stadium 14 tot en met stap 28), medaka embryo's vertonen golven van ritmische bewegingen over de contractiele periderm, een tissue laag die zowel de ontwikkelende embryo en de dooier ^5. Embryo's worden behandeld met 3,5 mm 1-heptanol om te stoppen met contractiele bewegingen ^6.

Om te stoppen met verplaatsing van embryo's na etappe 28 (64hpf), de embryo's worden verdoofd door het toevoegen van druppels tricaïne mesilaat (TMS) voor de inbedding. TMS wordt ook toegevoegd aan de agarose (voeg slechts een minimale hoeveelheid, deze dosis moet worden geoptimaliseerd, ongeveer een 1:25 verdunning).

1. Dooi een kleine hoeveelheid van 3% een lage temperatuur geleermiddel agarose (in 1X BSS) door verhitting tot 37 ° C en op deze temperatuur gehouden.
2. De volgende stappen moeten snel worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de agarose niet stollen voordat oriënteren het embryo. Met behulp van een brede mond glazen pipet overdracht genoeg gesmolten agarose aan de dop depressie van een eppendorfbuisje te vullen.
3. Overdracht een dechorionated embryo aan de dop depressie te minimaliseren over te dragen BSS met de embryo. Onmiddellijk de opname van de agarose en embryo uit de dop depressie en over te dragen aan een petrischaal cultuur kamer.
   
   Een 3.5cm petrischaal met een glazen venster op de bodem wordt gebruikt. Voor beeldvorming met behulp van een omgekeerde microscoop, de embryo's zijn gericht het lichaam naar beneden en plaatste de buurt van de dekglas. Voor beeldvorming met behulp van een microscoop rechtop, is de dikte van agarose geminimaliseerd.
   
   
4. Breng de 3.5cm petrischaal in een 14cm diameter Petri schaaltje met ijs en water (water gevuld tot ongeveer 1 / 3 totale diepte van de grote schotel). Terwijl u de kamer naar beneden stevig op de bodem van de petrischaal 14cm, gebruik maken van een lus om haar voorzichtig oriënteren het embryo als gewenst in het gesmolten agarose en houd het embryo tot aan de agarose stolt door zachtjes te verhogen en verlagen van de kleinere schaal in de oorspronkelijke stand in het ijskoude water.

4. Celtransplantatie in medaka embryo's

Het doel van deze procedure is om te bepalen of het gen van belang cel-autonoom (binnen een cel) of niet cel-autonoom (tussen de cellen) handelingen.

Donor cellen kunnen worden gelabeld met een tracer kleurstof, zoals rhodamine-dextran voorafgaand aan de transplantatie (zoals beschreven in "micro-injectie van Medaka Embryo's 'de bijbehorende Jupiter protocol) of een transgeen stam met GFP expressie kan worden gebruikt, waardoor transplantatie beoordeling. Een combinatie van beide technieken de etikettering is vaak handig om auto-fluorescentie die kan worden ondervonden te overwinnen. Voor time-lapse studies na transplantatie, GFP expressie is bijzonder nuttig.

Gebruik een brede mond glazen pipet met pipet pomp tijdens de gehele procedure en steriliseren alle tools (inclusief dia's) van tevoren met 70% EtOH, gevolgd door een grondige spoeling met steriel 1X BSS. De ontvanger embryo's worden meestal ontwikkeld rond het podium 12 aangezien dit discriminatie van de ventrale en dorsale palen bij het uitvoeren van de transplantatie.

1. Beginnen dechorionating embryo's 1,5 uur voorafgaand aan de transplantatie en setup injectie apparaat tijdens enzym incubaties.
2. Plaats een holte microscoopglaasje in een 9 cm diameter petrischaal. Voeg een kleine hoeveelheid van 3% methylcellulose naar het midden van de holte schuiven met behulp van een steriele pipet tip en de verspreiding in dunne plakjes.
3. Droge methylcellulose voor ongeveer 1-2 minuten.
4. Voeg 350μl van steriele 1X BSS te glijden depressie te vullen.
5. Overdracht een donor embryo en tot vier ontvanger embryo's om de dia met een glazen pipet.
6. Oriënteren embryo's met behulp van een haar lus, zodat de blastoderm van het embryo naar boven is gericht.
   
   Embryo's kunnen worden leunde tegen elkaar om verder te verhogen stabiliteit.
   
   
7. Steek de micro-naald in donor blastoderm en langzaam opname 10-20 cellen.
8. Steek de naald in vereiste oppervlakte van de ontvanger embryo blastoderm en langzaam verdrijven van de cellen. Grote zorgvuldigheid moet worden genomen bij het plaatsen van cellen in de ontvanger blastoderm om te voorkomen dat de cel-dooierzak grens verstoren omdat dit zal resulteren in de dood van het embryo.
9. Giet gesteriliseerd 1X BSS in de petrischaal.
   
   Giet voorzichtig de BSS in de schaal als aan de zijkant van de schotel zo dicht mogelijk, zodat er geen de embryo's te verstoren. Nooit rechtstreeks giet de BSS op de embryo's en voeg voldoende BSS zodanig dat de glijbaan en de embryo's ondergedompeld.
   
   
10. Voeg 100μl van penicilline / streptomycine aan het gerecht en de te dekken. Zorgvuldig overdragen schotel naar een 27 ° C incubator voor normale ontwikkeling mogelijk te maken.
11. Embryo's kunnen periodiek worden waargenomen zoals gewenst. Bij het gebruik van de transplantatie uit te voeren gain-of-functie en / of fenotype te redden experimenten, kunnen sommige waargenomen morfologische veranderingen te wijten zijn aan effecten van de transplantatie. Dus meerdere transplantaties nodig zijn. Na 2-3 dagen, moet melanoforen aanwezig zijn op de dooierzak, hoofd, ogen en romp. Indien aanwezig op de getransplanteerde embryo's vervolgens een succesvolle hersenschim is het meest waarschijnlijk is geproduceerd (figuur 3).

Indien nodig, genotype donor embryo (s) door de overdracht aan PCR tube (s) met 25μl van 20mg/ml proteinase K. Incubeer bij 55 ° C gedurende 4 uur gevolgd door 10 minuten bij 94 ° C en uit te voeren PCR.

5. Representatieve resultaten

Figuur 2. Voorbeeld positie van een agarose-embedded embryo. Anterior wordt getoond aan de rechterkant en te bekijken is dorsale. Panel B: endotheelcellen kan worden gezien aan beide zijden van het embryo lichaam en worden aangeduid met behulp van GFP aangestuurd door de FLI promotor.

Figuur 3. Beelden van na de transplantatie embryo's. Een afbeelding toont een donor en ontvanger embryo onmiddellijk na de transplantatie. De donor embryo wordt getoond aan de rechterkant met een volledig rode blastoderm (pijl). De ontvanger embryo wordt getoond aan de linkerkant en is gemakkelijk te herkennen door de kleine massa van de rode getransplanteerde cellen zichtbaar in de blastoderm (pijlpunt). Afbeelding B toont twee ontvanger embryo's ongeveer 7 uur na de transplantatie (geïncubeerd bij 27 ° C). Let op de getransplanteerde cellen zijn gemigreerd van de site van de transplantatie en zijn nu verspreid over de blastoderm (pijlen). Afbeelding C toont een ontvanger embryo bij st.29 (ongeveer 74hpf). Let op de pigmentatie in het oog en de aanwezigheid van melanoforen in de romp en de hersenen regio (pijlen). De rhodamine-gelabelde cellen kunnen worden gezien als koloniseren veel van de embryonale structuren met vermelding van de succesvolle productie van een hersenschim.

Discussion

In deze video laten we zien hoe dechorionate en uit te voeren cel transplanataion op medaka embryo's. Dit is een krachtige techniek om embryo's te produceren chimere voor de studie van gen / eiwit-functie tijdens de ontwikkeling, evenals voor het ophelderen van de autonomie van het gen / eiwit in kwestie. Medaka zijn een nuttige vertebrate modelsysteem voor deze techniek te wijten aan gevestigde lot kaarten en de transparantie lenen ze goed in vivo real-time beeldvorming. Transplantatie kan worden gecombineerd met micro-injectie (zoals aangegeven in "micro-injectie van Medaka Embryo's 'de bijbehorende Jupiter-protocol), zodat het gedrag van de getransplanteerde cellen kunnen gemakkelijk worden waargenomen.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Embryo medium	Reagent	Made in-house	N/A	200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.)
Micro-dissecting forceps	Tools	55 INOX A.DUMONT&FILS	N/A	Very sharp fine tips for removal of chorion.
Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size	Tools	Hermes Abrasives Ltd.	N/A	Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.
3% methylcellulose	Reagent	Sigma	M 0512	High viscosity for holding embryos in place during transplantation.
1X BSS	Reagent	Made in-house	N/A	20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO4.7H2O, 4g CaCl2.2H2O, and 10mg Phenol Red in 1L MilliQ water and autoclave; 500mM Hepes in MilliQ water autoclaved. Add 25ml 20XBSS and 15ml 500ml Hepes pH7.0, fill up to 500ml and filter sterilize before use.
Penicillin-streptomycin	Reagent	Gibco	15140-122	Added to BSS when incubating dechorionated embryos.
Pronase	Reagent	Calbiochem	53702	For dechorionation.
Hatching enzyme	Reagent	Made in-house	N/A	For dechorionation.
Tricaine mesilate (TMS)	Reagent	Sigma	A-5040	400mg tricaine in 97.9ml distilled water and 2.1ml 1M Tris, pH adjusted to 7; 4.2ml of this solution in 100ml clean tank water.
3% ultra-low gelling temp. agarose	Reagent	Sigma	A-2576	Type IX-A. Used during embedding of embryos for observation.
Petri dish culture chamber	Tool	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	11-004-008	Iwaki glass base dish 35mm with 12mm window. Used during embedding of embryos for observation.
Micromanipulator	Equipment	Narishige	N/A	Model MN151. For removal and insertion of cells during transplantation.
Borosilicate glass capillaries	Tool	Harvard Apparatus	GC100-10T	For making transplantation needles.
Flaming/Brown micropipette puller	Equipment	Sutter Instrument Co.	Model P-97	For making transplantation needles.