Dechorionation von Medaka Embryonen und Zell-Transplantation für die Erzeugung von Chimären

Summary

Aufgrund der harten und weichen Chorion Embryonen, die Manipulation von Embryonen medaka ist mehr als in Zebrafisch beteiligt. Dieses Video zeigt Schritt-für-Schritt-Anleitungen, wie Sie medaka Embryonen zu manipulieren, einschließlich dechorionation, Montage in Agarose für die Bildgebung und-Transplantation für die Herstellung von Chimären. Diese Verfahren sind unerlässlich, um medaka und Zebrafisch in einem Labor zu verwenden, um vollen Nutzen aus ihren komplementären Funktionen für die genetische Dissektion Vertebratengenom Funktionen übernehmen.

Abstract

Medaka ist eine kleine eierlegende Süßwasserfische, dass sowohl genetische und embryologische Analysen ermöglicht und ist eines der drei Wirbeltiere Modell-Organismen in die genomweite Phänotyp-driven Mutantenscreens out ¹ durchgeführt wurden. Divergenz der funktionellen Überlappung von Genen zwischen medaka und Zebrafisch ermöglicht die Identifizierung von neuen Phänotypen, die nicht identifizierbar sind in einer einzigen Spezies ^2, also medaka und Zebrafisch sind komplementär zur genetischen Dissektion der Vertebratengenom Funktionen. Manipulation von Embryonen medaka, wie dechorionation, Montage Embryonen für die Bildgebung und Stammzelltransplantation, sind wichtige Verfahren, die auf beiden medaka und Zebrafisch in einem Labor arbeiten. Zell-Transplantation untersucht Zelle Autonomie medaka Mutationen. Chimären sind durch die Transplantation von markierten Zellen vom Spender Embryonen in unbeschrifteten Empfänger Embryonen erzeugt. Donor-Zellen können auf bestimmte Bereiche des Empfängers Embryonen auf das Schicksal Karten ³ basiert, so dass Klone aus transplantierten Zellen können in das Gewebe von Interesse bei der Entwicklung integriert werden umgepflanzt werden. Aufgrund der harten und weichen Chorion Embryonen, die Manipulation von Embryonen medaka ist mehr als in Zebrafisch beteiligt. In diesem Video zeigen wir detaillierte Verfahren zur medaka Embryonen zu manipulieren.

Protocol

1. Entwicklung der Embryonen

1. Wenn sie verlegt werden, sind Eier, weil der Befestigung Filamente auf dem Chorion geclustert. Zu vermieten Embryonen normal entwickeln, ist es notwendig, Eier trennen. Tangle und schneiden Befestigung Filamente, indem die Anlage Filamente mit zwei Pinzetten.
2. Nach unclustering sind Eier aus Kot und Algen abgetrennt und an die frische Embryo Medium bei einer maximalen Dichte von 40 Eiern pro 6cm Petrischale.
3. Medaka Embryonen entwickeln etwas langsamer als Zebrafisch bei 27 ° C. Der Zeitpunkt der Brut ist der Unterschied zwischen den beiden Arten; medaka Embryonen schlüpfen aus dem Chorion in 7 Tagen und beginnt sofort zu schwimmen und zu essen, während Zebrafischembryonen in 2 Tagen schlüpfen, sondern beginnen zu schwimmen und in 5-6 Tagen essen. Entwicklung von medaka ist nach Iwamatsu Inszenierung ⁴ statt.
4. Die Entwicklung der medaka Embryonen lassen sich bequem zu experimentellen Pläne werden durch eine entsprechende Temperatur eingestellt. Entwicklung von medaka Embryonen können bei 4 ° C in der frühen Entwicklung gestoppt werden. Nach Stufe 24, wenn Herzschlag beginnt, kann die Entwicklung verlangsamt mit einer Mindesttemperatur von 18 ° C betragen
5. Der Zeitpunkt des Auftretens der Organe / Gewebe ist etwas anders in medaka verglichen mit Zebrafisch, dh es kommt in medaka Somitogenese nach dem Beginn der Entwicklung des Gehirns während im Zebrafisch somitegenesis geht die Entwicklung des Gehirns.

2. Entfernen des Chorion

Das Chorion der medaka besteht aus zwei Schutzschichten mit einer harten Innenschicht und einer weichen äußeren Oberfläche. So ist eine Zwei-Schritt-Protease-Behandlung unter Verwendung Pronase und Schraffuren Enzym notwendig, diese Chorion zu entfernen.

Sobald dechorionated, Embryonen sollten in 1X BSS gehalten werden. Semi-sterilen Bedingungen wird erhöhen die erfolgreiche Kultur von dechorionated Embryonen, vor allem, wenn längere Beobachtung erforderlich sind. Dazu zählen mit sterilen Lösungen (zB sterilisiert 1X BSS mit Antibiotika) und Werkzeuge mit 70% Ethanol durch Spülen mit 1X BSS gefolgt sterilisiert.

Als dechorionated medaka Embryonen weicher und zerbrechlicher als dechorionated Zebrafischembryonen sind, müssen besonders sorgfältig darauf zu achten, sie nicht berühren Luft oder Luftblasen in der Pipette, da diese unmittelbaren Zusammenbruch führen wird. Um sicherzustellen, minimaler Schädigung von Embryonen, sollte ein weitmündigen Wärme polierte Glaspipette mit Pipette zum Fördern Embryonen verwendet werden und ein Haar Schleife sollte genutzt werden, um Embryonen für die Beobachtung orientieren werden. Nichtadhärente Petrischalen sollten verwendet werden, um Embryonen aus verbundenen Flächen zu verhindern.

1. Vor dechorionation sollte geprüft werden, die Eier wurden ausreichend getrennt und gereinigt-up sein.
2. Da beide Pronase und Schraffuren Enzyme Proteinasen sind, sollten sie auf Eis gehalten werden und Minimierung der Exposition von Embryonen, um diese Enzyme.
3. Transfer-Eier Schleifpapier (p2000 Korn, wasserdicht) in den Deckel eines 9cm Petrischale. Entfernen Sie überschüssiges Medium, sondern sorgen für eine ausreichende Lautstärke bleibt zu verhindern Trocknung von Embryonen.
4. Sanft rollen Embryonen für etwa 45-60 Sekunden, um einige der äußeren Oberfläche Haare zu entfernen und leicht Partitur der Oberfläche des Chorion (Abbildung 1). Transfer-Embryonen zurück zur ursprünglichen Petrischale und zu untersuchen.
   
   Beim Walzen von Embryonen auf Sandpapier den Zeigefinger zu verwenden, die Anwendung minimal Druck und halten den Finger parallel zur Oberfläche des Sandes Papier. Rollen Sie nicht mehr als 5-7 Embryonen auf einmal. Diese Vorsichtsmaßnahme wird das Risiko von Quetschungen Embryonen unter einander.
   
   
5. Ersetzen Ei Medium in Schale mit 20mg/ml Pronase und inkubieren Embryonen für 40-60 Minuten bei 27 ° C.
   
   Stellen Sie sicher, Embryonen sind ausreichend Pronase abgedeckt und ein Deckel auf dem Teller. Ungenutzte Pronase sollte auf Eis während dieser Schritt in die Selbständigkeit Verdauung zu minimieren gehalten werden und kann wiederverwendet, bis Aktivität verloren geht (ca. 1-2 Wochen) werden.
   
   
6. Recover Pronase für die Wiederverwendung und waschen Embryonen 5X in Embryo Medium, um Spuren von Pronase zu entfernen, da dies die Schraffur Enzym zu inaktivieren wird hinzugefügt werden.
7. Entfernen Embryo mittel-und Deckel Embryonen mit dem Schlüpfen Enzym, wodurch Embryonen sitzen als Monolayer in die Schüssel.
   
   Wenn Eier auf der Oberseite von einander sitzen in der Schale, werden diese an der Unterseite gebrochen als das Chorion auflöst. Bewahren Sie unbenutzte Schlüpfen Enzym auf Eis.
   
   
8. Inkubieren Embryonen bei 27 ° C und nach 15 Minuten regelmäßig die Fortschritte der Schlupf mit einem Stereomikroskop.
   
   Man wird sehen, dass eine Reihe von Mondkrater wie Löcher in der inneren Schicht des Chorion, die bald löst sich nach dieser Verlassen der weiche Außenschicht des Chorion leicht entfernt manuall erscheinen beginneny. Der gesamte Prozess der Schraffur kann 15-60 Minuten.
   
   
9. Sobald Embryonen aus dem Chorion kommen-Embryonen zu einer Petrischale mit 1X BSS.
   
   Stellen Sie sicher, nicht zu dem Schlüpfen Enzyms an das 1X BSS Übertragung durch Berührung der Spitze der Pipette auf die Oberfläche des BSS so dass die Embryonen vorsichtig ausrollen.
   
   
10. Sobald alle Embryonen aus dem Schlüpfen Enzym übertragen werden, um eine endgültige Übertragung auf ein anderes frisches Gericht 1X BSS.
    
    Dadurch wird sichergestellt, Embryonen nicht auf irgendwelche Reste von Schraffuren Enzym ausgesetzt, da dieser exponierten Embryonen beschädigt wird. Nachdem in diesem letzten Gericht keine Embryonen noch im Besitz der äußeren Schicht des Chorion kann manuell befreit Verwendung sterilisiert Mikro-Pinzette unter dem Stereomikroskop.
    
    Wenn Embryonen entwickelt folgende dechorionation werden müssen, sollten Penicillin / Streptomycin auf die BSS hinzugefügt werden, um das Bakterienwachstum zu verhindern.
    
    

Abbildung 1. Vergleich von Walz-und abgerollt Embryonen während dechorionation. Beobachten Sie, wie das gerollte Embryonen in Panel B die Haare auf dem entrollten Embryonen in Panel A. gesehen Mangel

3. Montage dechorionated Embryonen

Agarose eingebettet ist für längere Bildgebung (z. B. Time-Lapse-Imaging) für Live-Embryonen sowie für detaillierte Beobachtungen der festen Embryonen sinnvoll. Während der Gastrulation und der frühen Organogenese (Stufe 14 bis Stufe 28), weisen medaka Embryonen Wellen von rhythmischen Bewegungen über die kontraktilen Periderm, eine Gewebeschicht, die sowohl den sich entwickelnden Embryo und das Eigelb ^5. Die Embryonen werden mit 3,5-mm-1-Heptanol behandelt zu stoppen kontraktilen Bewegungen ^6.

So stoppen Sie Bewegung der Embryonen nach der Stufe 28 (64hpf) sind Embryonen betäubt, indem Tropfen Tricaine mesilate (TMS) vor dem Einbetten. TMS ist auch für die Agarose hinzugefügt (add nur eine minimale Menge, die Dosis muss optimiert werden, etwa 1:25 Verdünnung).

1. Thaw eine kleine Menge von 3% niedriger Geliertemperatur Agarose (in 1X BSS) durch Erhitzen auf 37 ° C und bei dieser Temperatur zu halten.
2. Die folgenden Schritte müssen zügig werden, um sicherzustellen, dass die Agarose nicht vor Orientierung des Embryos zu verfestigen durchgeführt. Mit einem weitmündigen Glaspipette Transfer genug geschmolzene Agarose auf die Kappe von Depressionen ein Eppendorf-Röhrchen zu füllen.
3. Transfer ein dechorionated Embryo in die Kappe Depressionen zu minimieren, die mehr als BSS mit dem Embryo. Sofort-Aufnahme der Agarose und Embryo aus der Kappe Depression und Transfer in eine Petrischale Kultur Kammer.
   
   Ein 3,5 cm Petrischale mit einem Glasfenster am Boden verwendet wird. Für die Bildgebung mit Hilfe eines inversen Mikroskops, sind Embryonen ausgerichtet Körper nach unten und legte nahe dem Deckglas. Für die Bildgebung mit einem aufrechten Mikroskop, ist die Dicke der Agarose minimiert.
   
   
4. Übertragen Sie die 3.5cm Petrischale in eine 14cm Durchmesser Petrischale mit Eis und Wasser (auf etwa 1 / 3 Tiefe von insgesamt große Schüssel gefüllt). Während Sie die Kammer fest auf dem Boden des 14cm Petrischale mit einem Haar-Schleife, um sanft zu orientieren den Embryo als in der geschmolzenen Agarose gewünschten und halten den Embryo, bis die Agarose erstarrt durch leichtes Heben und Senken der kleineren Schüssel in seine ursprüngliche Position in das eiskalte Wasser.

4. Zell-Transplantation in medaka Embryonen

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, festzustellen, ob das Gen von Interesse Zell-autonome (innerhalb einer Zelle) oder nicht-zell-autonom (zwischen den Zellen) handelt.

Spenderzellen mit einem Markierungsfarbstoff wie Rhodamin-Dextran vor der Transplantation (wie in der beiliegenden JoVE Protokoll "Mikroinjektion von Medaka Embryos" beschrieben) oder eine transgene Sorte mit GFP-Expression genutzt werden kann beschriftet werden, so dass die Transplantation Beurteilung. Eine Kombination beider Techniken Kennzeichnung ist oft nützlich, Autofluoreszenz, die auftreten können überwunden werden. Für Zeitraffer-Studien nach der Transplantation ist die GFP-Expression besonders nützlich.

Verwenden Sie einen weitmündigen Glaspipette mit Pipette Pumpe während des gesamten Verfahrens und sterilisieren alle Werkzeuge (einschließlich Folien) zuvor mit 70% EtOH gefolgt von gründlichem Spülen mit steriler 1X BSS. Empfänger Embryonen sind in der Regel auf etwa Stufe 12 entwickelt, da dies ermöglicht Diskriminierung der ventralen und dorsalen Pole bei der Durchführung der Transplantation.

1. Commence dechorionating Embryonen 1,5 Stunden vor der Transplantation und Setup Injektionsgeräts während Enzyminkubationen.
2. Legen Sie ein Hohlraum Objektträger in eine 9cm Durchmesser Petrischale. Fügen Sie einen kleinen Betrag von 3% Methylcellulose in die Mitte des Hohlraums Rutsche mit einer sterilen Pipettenspitze und Verbreitung dünn.
3. Dry Methylcellulose für ca. 1-2 Minuten.
4. Fügen Sie 350μl steriles 1X BSS zu rutschen Depression zu füllen.
5. Transfer von einem Spender Embryo und bis zu vier Empfänger Embryonen, um die Folie mit einer Glaspipette.
6. Orientieren Embryonen mit einem Haar-Schleife so Blastoderm des Embryos nach oben zeigt.
   
   Embryonen können lehnte sich gegenseitig zu weiteren Erhöhung der Stabilität.
   
   
7. Schieben Sie die Micro-Nadel in Spenders Blastoderm und langsam Aufnahme 10-20 Zellen.
8. Schieben Sie Nadel in die gewünschte Fläche des Empfängers Embryo Blastoderm und vertreiben die Zellen langsam. Große Vorsicht ist geboten beim Einsetzen Zellen in den Rezipienten Blastoderm, um nicht die Zell-Dottersack Grenze zu stören, als dies in den Tod des Embryos führen wird.
9. Gießen sterilisiert 1X BSS in der Petrischale.
   
   Gießen Sie die BSS in Schale, um die Seite der Schale nah wie möglich, um nicht die Embryonen stören. Gießen Sie niemals die BSS direkt auf die Embryonen, und fügen Sie ausreichend BSS, dass der Schieber und Embryonen eingetaucht sind.
   
   
10. Add 100 &mgr; von Penicillin / Streptomycin in die Schale und Deckel. Sorgfältig Transfer Gericht zu einer 27 ° C Inkubator für eine normale Entwicklung zu ermöglichen.
11. Embryonen können in regelmäßigen Abständen beobachtet werden, wie gewünscht. Bei der Verwendung von Transplantation durchzuführen gain-of-function-und / oder Phänotyp zu retten Experimente könnten einige morphologische Veränderungen beobachtet werden aufgrund der Auswirkungen der Transplantation. Somit können mehrere Transplantationen notwendig sind. Nach 2-3 Tagen sollten Melanophoren werden auf dem Dottersack, Kopf, Augen und des Rumpfes. Falls vorhanden auf transplantierten Embryonen dann eine erfolgreiche Chimäre hat höchstwahrscheinlich produziert worden (Abbildung 3).

Wenn nötig, Genotyp Spender Embryo (s) durch Übertragung von PCR-Röhrchen (s) mit 25 &mgr; l von 20mg/ml Proteinase K. Inkubation bei 55 ° C für 4 Stunden mit 10 Minuten bei 94 ° C und Durchführung der PCR.

5. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 2. Beispiel Position eines Agarose eingebettete Embryo. Anterior ist auf der rechten Seite angezeigt und Ansicht ist dorsal. Panel B: Endothelzellen kann auf beiden Seiten des Embryos Körper gesehen werden und sind beschriftet mit GFP durch die fli-Promotor angetrieben.

Abbildung 3. Images of post-Transplantation Embryonen. Bild A zeigt einen Spender und Empfänger Embryo sofort nach der Transplantation. Der Spender Embryo ist auf der rechten Seite mit einem komplett roten Blastoderm (Pfeil) dargestellt. Der Empfänger Embryo ist auf der linken Seite gezeigt und ist leicht durch die geringe Masse der roten transplantierten Zellen sichtbar im Blastoderm (Pfeilspitze) identifiziert. Bild B zeigt zwei Empfänger Embryonen etwa 7 Stunden nach der Transplantation (bei 27 ° C). Beachten Sie die transplantierten Zellen vom Ort der Transplantation migriert und sind nun in der Blastoderm (Pfeile) verteilt. Bild C zeigt einen Empfänger Embryo st.29 (ca. 74hpf). Beachten Sie die Pigmentierung in die Augen und die Anwesenheit von Melanophoren in den Kofferraum und Hirnregion (Pfeile). Die Rhodamin-markierten Zellen sichtbar zu sein besiedeln viele der embryonalen Strukturen zeigt die erfolgreiche Produktion von einer Chimäre werden.

Discussion

In diesem Video zeigen wir, wie man dechorionate und durchzuführen Zelle transplanataion auf medaka Embryonen. Dies ist eine kraftvolle Technik, um chimäre Embryonen für die Untersuchung von Gen / Protein-Funktion während der Entwicklung als auch für die Aufklärung der Autonomie der Gen / Protein in Frage zu produzieren. Medaka sind ein nützliches Wirbeltier-Modellsystem für diese Technik aufgrund der gut etablierten Schicksal Karten und ihre Transparenz verleihen ihnen auch in vivo-Bildgebung in Echtzeit. Transplantation kann mit Mikroinjektion (wie in der beiliegenden JoVE Protokoll "Mikroinjektion von Medaka Embryonen 'beschrieben), so dass das Verhalten der transplantierten Zellen leicht beobachtet werden können kombiniert werden.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Embryo medium	Reagent	Made in-house	N/A	200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.)
Micro-dissecting forceps	Tools	55 INOX A.DUMONT&FILS	N/A	Very sharp fine tips for removal of chorion.
Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size	Tools	Hermes Abrasives Ltd.	N/A	Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.
3% methylcellulose	Reagent	Sigma	M 0512	High viscosity for holding embryos in place during transplantation.
1X BSS	Reagent	Made in-house	N/A	20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO4.7H2O, 4g CaCl2.2H2O, and 10mg Phenol Red in 1L MilliQ water and autoclave; 500mM Hepes in MilliQ water autoclaved. Add 25ml 20XBSS and 15ml 500ml Hepes pH7.0, fill up to 500ml and filter sterilize before use.
Penicillin-streptomycin	Reagent	Gibco	15140-122	Added to BSS when incubating dechorionated embryos.
Pronase	Reagent	Calbiochem	53702	For dechorionation.
Hatching enzyme	Reagent	Made in-house	N/A	For dechorionation.
Tricaine mesilate (TMS)	Reagent	Sigma	A-5040	400mg tricaine in 97.9ml distilled water and 2.1ml 1M Tris, pH adjusted to 7; 4.2ml of this solution in 100ml clean tank water.
3% ultra-low gelling temp. agarose	Reagent	Sigma	A-2576	Type IX-A. Used during embedding of embryos for observation.
Petri dish culture chamber	Tool	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	11-004-008	Iwaki glass base dish 35mm with 12mm window. Used during embedding of embryos for observation.
Micromanipulator	Equipment	Narishige	N/A	Model MN151. For removal and insertion of cells during transplantation.
Borosilicate glass capillaries	Tool	Harvard Apparatus	GC100-10T	For making transplantation needles.
Flaming/Brown micropipette puller	Equipment	Sutter Instrument Co.	Model P-97	For making transplantation needles.