Summary
ハード絨毛膜とソフト胚による、メダカ胚の操作は、ゼブラフィッシュにおけるよりも複雑です。このビデオでは、キメラの生産のためのイメージングと細胞移植のためにアガロースに取付け、dechorionation含むメダカ胚を操作する方法のためのステップバイステップの手順を示しています。これらの手順は、脊椎動物のゲノム機能の遺伝的解剖のためにそれらの補完的な機能をフルに活用するために実験室でのメダカとゼブラフィッシュを使用するために不可欠です。
Abstract
メダカは、遺伝子と発生学の両方の分析を可能にし、ゲノムワイドな表現型主導型の変異体の画面が1を実施された3つの脊椎動物のモデル生物の一つである小規模な産卵淡水魚です。メダカとゼブラフィッシュの間に関連する遺伝子の機能重複の相違は、単一の種2の識別不能な新規な表現型の同定を可能にする、このようにメダカとゼブラフィッシュは、脊椎動物のゲノム機能の遺伝的解剖のための補完的です。このようなdechorionationとしてメダカ胚の操作、画像処理および細胞移植のためのマウント胚は、研究室でメダカとゼブラフィッシュの両方で動作する主要な手順です。細胞移植は、メダカの突然変異の細胞の自律性を調べます。キメラは、ラベルのないレシピエント胚にドナー胚からの標識された細胞を移植することにより生成されます。ドナー細胞を移植された細胞からのクローンが開発中の関心の組織に統合できるように、運命のマップ3に基づいて受信者の胚の特定の領域に移植することができる。ハード絨毛膜とソフト胚による、メダカ胚の操作は、ゼブラフィッシュにおけるよりも複雑です。このビデオでは、我々は、メダカの胚を操作するための詳細な手順を示しています。
Protocol
1。胚の開発
- それらが配置されているときに、卵が原因絨毛膜上に添付ファイルのフィラメントのクラスタ化されています。胚が正常に発達させるには、それは別の卵に必要です。もつれ二鉗子で添付ファイルのフィラメントを保持することによって、添付ファイルのフィラメントをカット。
- クラスタを解除した後、卵は糞便や藻類から分離され、6センチメートルペトリ皿あたり40卵の最大密度での新鮮胚の培地に移した。
- メダカ胚は27でゼブラフィッシュよりも若干遅い開発℃をゼブラフィッシュの胚は、2日で孵化するが5-6日で泳ぐと食事を始めるのに対し、7日間の絨毛膜からメダカ胚の孵化とすぐに泳ぐと食事を開始、孵化のタイミングは、2種間で異なっている。メダカの開発は、岩松のステージング4に基づいて上演されている。
- メダカ胚の開発が便利に適切な温度を選択することにより、実験計画に調整することができます。メダカ胚の開発は、開発初期段階で4 ° Cで停止することができます。ステージ24の後に心臓の鼓動の起動時に、開発は18の最低温度℃を用いて減速することができます
- ゼブラフィッシュのsomitegenesisで脳の発達に先行するのに対し、臓器/組織の出現のタイミングは、ゼブラフィッシュと比較してメダカにわずかに異なる場合、メダカの体節形成のすなわち脳の発達の開始後に発生します。
2。絨毛膜の除去
メダカの絨毛膜は、ハード内層と柔らかい外表面を持つ2つの保護層で構成されています。したがって、二段階プロテアーゼ処理採用プロナーゼと孵化酵素は、この絨毛膜を除去する必要があります。
一度dechorionated、胚は1X BSSに保管してください。半無菌状態は観察の長い期間が必要な場合は特に、dechorionated胚の正常な文化を向上させます。これらは、1X BSSで洗浄に続いて70％エタノールで滅菌無菌溶液（例えば、抗生物質で1X BSSを滅菌）とツールを使用して含まれています。
dechorionatedメダカ胚では、特別な注意dechorionatedゼブラフィッシュの胚より柔らかく、より壊れやすいため、この関数は即座に崩壊の原因となるので、彼らは、ピペット内の空気や泡が接触しないように注意する必要があります。胚に与えるダメージを最小限を確保するために、ピペットポンプ付きの広口熱研磨したガラスピペットを転送する胚を使用する必要がありますし、毛のループが観察のための胚をオリエンテーションするために利用されるべきである。非接着性ペトリ皿は、表面に付着する胚を防止するために使用する必要があります。
- 前のdechorionationには卵が十分に分離してクリーンアップされていることをチェックする必要があります。
- プロナーゼと孵化酵素の両方がプロテアーゼなので、氷上に保持され、これらの酵素の胚の曝露を最小限にする必要があります。
- 9センチメートルペトリ皿の蓋に置かれたサンドペーパー（P2000グリットサイズ、防水）に卵を移す。余分な培地を除去しますが、胚の乾燥を防ぐために十分な量が残っていることを確認してください。
- ゆっくりと外側の表面の毛の一部を削除し、軽く絨毛膜の表面（図1）を獲得するために約45〜60秒間、胚をロールバックします。オリジナルのペトリ皿に戻す胚を移し、調べる。
紙やすりでするときにローリング胚は、最小限の圧力を適用し、サンドペーパーの表面に指を平行に保ち、人差し指を使用してください。一度に5月7日胚よりも多くをロールバックしないでください。この予防措置は、お互いの下胚の破砕のリスクを最小限に抑えられます。 - 27で40〜60分のための20mg/mlプロナーゼとインキュベートの胚と皿の中で卵の培地を交換℃に
胚が十分にプロナーゼによってカバーと蓋が皿上に存在していることを確認します。未使用のプロナーゼは自己消化を最小限に抑えるために、このステップの間に氷上で保存すると活性が失われるまで（約1〜2週間）再利用することができます。 - 再利用のためのプロナーゼを回復し、これが追加される孵化酵素を不活性化するとしてプロナーゼの痕跡を除去するために胚の培地で5倍の胚を洗浄する。
- 胚の培養液を除去し、孵化酵素との胚をカバーし、胚が皿に単層として座って確保。
卵は皿の中で互いの上に座っている場合絨毛膜が溶解すると、下部のものは潰される。氷の上に未使用の孵化酵素を保つ。 - 27で胚をインキュベート° C、15分後に定期的に実体顕微鏡を用いて孵化の進行状況を確認。
それは月のクレーターのような穴の数がすぐに続く、これが簡単にmanuallを削除した絨毛膜の柔らかい外側の層を残して溶解する絨毛膜の内層に現れ始めることが見られるY.孵化のプロセス全体では15〜60分かかることがあります。 - とすぐに胚が漿膜から出てくるように、1X BSSを含むシャーレに胚を移す。
胚は優しくロールアウトできるようにすることBSSの表面にピペットの先端に触れることで1X BSSに孵化酵素を転送しないことを確認します。 - すべての胚を孵化酵素から転送されると、1X BSSの別の新鮮な料理への最終的な転送を行います。
これは、これが公開された胚を損傷すると胚は、孵化酵素のいずれかの残党にさらされないようにします。一度この最後の皿にはまだ絨毛膜の外側の層を有する任意の胚は、実体顕微鏡下で滅菌マイクロ鉗子を使用して手動で解放することができます。
胚は、以下のdechorionationを開発する必要がある場合は、ペニシリン/ストレプトマイシンは、細菌の増殖を防ぐためにBSSに追加する必要があります。
図1。dechorionation中に圧延し、展開された胚の比較。パネルBの圧延胚はパネルAのアンロール胚に見られる毛を欠いているかを観察
3。取付dechorionated胚
アガロース包埋は、ライブ胚のイメージングの長い期間（例えばタイムラプスイメージング）のためだけでなく、固定された胚の詳細な観察に便利です。原腸形成と初期の器官形成（ステージ28〜ステージ14）の間に、メダカの胚は、周皮、胚および卵黄5の両方を覆う組織の層全体でリズミカルな収縮運動の波を示す。胚は収縮の動き6を停止するには3.5mmの1 -ヘプタノールで処理されています。
ステージ28（64hpf）後の胚の移動を停止するには、胚は、埋め込む前Tricaineメシル酸（TMS）の滴を追加することで麻酔。 TMSは、アガロース（約のみ最小限の金額、この投与量は、最適化する必要がある、1:25希釈を追加）に追加されます。
- ° Cと、この温度で維持するため37〜加熱3％低ゲル化温度アガロース（1X BSSにおける）の少量を解凍。
- 次の手順では、アガロースが胚をorientatingする前に固化していないことを保証するために迅速に実施する必要があります。エッペンドルフチューブのキャップのうつ病を埋めるために広口ガラスピペットの転送に十分な溶融アガロースを使用する。
- 胚でBSSを引き継いで最小限に抑えキャップのうつ病一つdechorionated胚を移す。すぐに取り込みアガロースとキャップのうつ病とペトリ皿の培養チャンバーへの転送から胚。
下部のガラス窓付き3.5センチメートルペトリ皿が使用されます。倒立顕微鏡を用いてイメージングのために、胚は指向ボディ下向きですとカバーガラスの近くに配置。正立顕微鏡を使用してイメージングするため、アガロースの厚さが最小化されます。 - 氷と水を（水は大きな皿のおよそ1 / 3の合計の深さに埋め）を含む14センチメートル直径のシャーレに3.5センチメートルペトリ皿に移す。 14センチメートルペトリ皿の底にしっかりとチャンバーを押しながら、静かに溶融アガロースで必要に応じて、胚をオリエンテーションし、アガロースがそっと元の位置に小さな皿を昇降させることにより固化するまで胚を保持するために毛のループを使用氷のように冷たい水中で
4。メダカ胚における細胞移植
この手順の目的は、目的の遺伝子が細胞自律的（細胞内）または非細胞自律的に（細胞間）作用するかどうかを判断することです。
ドナー細胞は、移植前にそのようなローダミン-デキストランのようなトレーサー色素で標識することができます（添付のJoveのプロトコル"メダカ胚のマイクロインジェクション"に記載されている）またはGFP発現トランスジェニック系統は、移植の評価をできるように、用いることができる。両方の標識技術の組み合わせは、しばしば遭遇することができる自家蛍光を克服するのに便利です。移植後の時間経過の研究については、GFPの発現に特に便利です。
この手順のピペットポンプで広口ガラスピペットを使用すると70％EtOHで事前にすべてのツールを（スライドを含む）滅菌は、滅菌1X BSSで完全に洗い流すことが続きます。これは移植を実施する腹側と背側のポールの差別を許す限り、受信者の胚は、通常約ステージ12に開発されています。
- 前の酵素のインキュベーションの間の移植とセットアップの注入装置に1.5時間dechorionating胚を開始。
- 9センチメートル直径シャーレに空洞の顕微鏡スライドを置きます。 滅菌ピペットチップを用いて空洞のスライドの中央に3％メチルセルロースの少量を追加し、薄く広がった。
- 約1〜2分間乾燥メチルセルロース。
- スライドのうつ病を埋めるために滅菌1X BSSの350μLを追加。
- ガラスピペットを用いてスライドに1つのドナー胚と最大4つの受信者の胚を移す。
- 胚の胚盤葉が上を向いているので、髪のループを使用して親しませる胚。
胚は、安定性をさらに高めるために互いにleantすることができます。 - ゆっくりとドナー胚盤葉と徐々に取り込み10月20日細胞にマイクロニードルを挿入する。
- ゆっくりと受信者の胚の胚盤葉の必要な領域に針を挿入し、徐々に細胞を追放する。レシピエント胚盤葉にセルを挿入するときに細心の注意が取られるべきであるので、このような細胞卵黄嚢の境界を妨害しないように胚の死に至ることになります。
- シャーレに滅菌1X BSSを注ぐ。
できるだけ皿の側面に近いが、そのような胚を妨害しないように慎重に皿にBSSを注ぐ。胚に直接BSSを注いでは、スライドや胚を浸漬されるような十分なBSSを追加しないでください。 - 皿とカバーにペニシリン/ストレプトマイシン100μLを加える。慎重に正常な発展を可能にするために27℃インキュベーターに料理を転送する。
- 胚は定期的に必要に応じて観察することができます。機能獲得型および/または表現型のレスキュー実験を行うために移植を使用する場合、観察される幾つかの形態学的変化は、移植の影響による可能性がある。したがって、複数の移植が必要です。 2〜3日後、色素胞は卵黄嚢、頭、目およびトランク上に存在する必要があります。移植胚に存在するが、成功したキメラ可能性が最も高い生産されている場合（図3）。
もし55℃94℃10分に続いて4時間C ° CとPCRを行う。で20mg/ml Proteinase Kをインキュベートの25μlの入ったPCRチューブ（s）に転送して必要な、遺伝子型のドナー胚（S）
5。代表的な結果
図2。アガロース包埋の胚の例の位置。前方には、右側に表示され、ビューは背側です。パネルB：血管内皮細胞は胚体のどちら側でも見ることができるとFLIのプロモーターによって駆動されるGFPを用いて標識されています。
図3。移植後の胚の画像。画像はすぐに移植後のドナーとレシピエント胚を示しています。ドナー胚は完全に赤の胚盤葉（矢印）を右に示されています。受信者の胚では左側に表示されており、簡単には胚盤葉（矢じり）で可視赤色移植細胞の小さな塊によって識別されます。画像Bは2つの受信者の胚を示し、約7時間後の移植（27 ° Cでインキュベートした）。移植された細胞は、移植のサイトから移行した、現在胚盤葉（矢印）に分散されています注意してください。画像Cはst.29（約74hpf）での受信者の胚を示しています。目の色素沈着とトランクと脳領域での色素胞（矢印）の存在に注意してください。ローダミン標識細胞は、キメラの成功した生産を示す胚の構造の多くを植民地されるとみることができる。
Discussion
このビデオでは、dechorionateとメダカ胚の細胞のtransplanataionを実施する方法を示します。これは、問題の遺伝子/タンパク質の自律性を解明するためだけでなく、開発中の遺伝子/タンパク質機能の研究のためのキメラ胚を作成する強力な手法です。メダカは、 生体内リアルタイムイメージングのためにも、それらを貸す十分に確立された運命のマップとその透明性のためにこのテクニックのための有用な脊椎動物モデル系です。移植は、移植細胞の挙動を容易に観察できるようにマイクロインジェクション（添付のJoveのプロトコル"メダカ胚のマイクロインジェクション"に記載されている）と組み合わせることができます。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、MRCからM. FSへの助成金によってサポートされています。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo medium | Reagent | Made in-house | N/A | 200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.) |
| Micro-dissecting forceps | Tools | 55 INOX A.DUMONT&FILS | N/A | Very sharp fine tips for removal of chorion. |
| Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size | Tools | Hermes Abrasives Ltd. | N/A | Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions. |
| 3% methylcellulose | Reagent | Sigma | M 0512 | High viscosity for holding embryos in place during transplantation. |
| 1X BSS | Reagent | Made in-house | N/A | 20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO4.7H2O, 4g CaCl2.2H2O, and 10mg Phenol Red in 1L MilliQ water and autoclave; 500mM Hepes in MilliQ water autoclaved. Add 25ml 20XBSS and 15ml 500ml Hepes pH7.0, fill up to 500ml and filter sterilize before use. |
| Penicillin-streptomycin | Reagent | Gibco | 15140-122 | Added to BSS when incubating dechorionated embryos. |
| Pronase | Reagent | Calbiochem | 53702 | For dechorionation. |
| Hatching enzyme | Reagent | Made in-house | N/A | For dechorionation. |
| Tricaine mesilate (TMS) | Reagent | Sigma | A-5040 | 400mg tricaine in 97.9ml distilled water and 2.1ml 1M Tris, pH adjusted to 7; 4.2ml of this solution in 100ml clean tank water. |
| 3% ultra-low gelling temp. agarose | Reagent | Sigma | A-2576 | Type IX-A. Used during embedding of embryos for observation. |
| Petri dish culture chamber | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 11-004-008 | Iwaki glass base dish 35mm with 12mm window. Used during embedding of embryos for observation. |
| Micromanipulator | Equipment | Narishige | N/A | Model MN151. For removal and insertion of cells during transplantation. |
| Borosilicate glass capillaries | Tool | Harvard Apparatus | GC100-10T | For making transplantation needles. |
| Flaming/Brown micropipette puller | Equipment | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | For making transplantation needles. |
References
- Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes. Mech Dev. 121, 647-658 (2004).
- Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study. Mech Dev. 121, 629-6237 (2004).
- Hirose, Y., Varga, Z. M., Kondoh, H., Furutani-Seiki, M. Single cell lineage and regionalization of cell populations during Medaka neurulation. Development. 131, 2553-2563 (2004).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Zool Sci. 11, 825-839 (1994).
- Cope, J., Fluck, R., Nicklas, L., Plumhoff, L. A., Sincock, S. The stellate layer and rhythmic contractions of the Oryzias latipes embryo. J Exp Zool. 254, 270-275 (1990).
- Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization. J Vis Exp. , (2009).
