Summary
Это видео продемонстрирует методы transurethrally вызвать мыши инфекции мочевыводящих путей и количественной оценки степени в результате инфекции.
Abstract
Уропатогенных штаммов бактерий, представляющих интерес, выращенные на агаре. Как правило, уропатогенных
Protocol
I. Подготовка уретры Катетеры
- Для каждого мочевого пузыря и почек мыши для пробы, место 5-6 шарики из нержавеющей стали (мочевой пузырь, размером 1,6 мм или 0,9-2,0 мм смесь) или циркония бисером азота (почки, размер 0,5 мм) в одном криопробирку трубка, соответственно. Автоклав бусинка содержащих труб.
- После трубы охладить до комнатной температуры, добавить 200 мкл стерильной PBS, чтобы каждый из нержавеющей стали бусинка содержащих трубки и 400 мкл стерильной PBS для каждого оксида циркония бусинка содержащих трубки.
- Мы готовим уретрального катетера, как описано в Хунг и Hultgren 13. Автоклав чистые пары с плоской головкой щипцы и ножницы штраф (диафрагма или аналогичного типа) и позволяют инструменты для охлаждения до комнатной температуры. Протрите поверхности капота ламинарного потока с 70% этанола. В капот, вырезать 30 см (приблизительно) сегменте полиэтиленовых труб. Асептических место стерильные иглы 30 (1 / 2 дюйма длиной иглой) на 3 см стерильного шприца. Возьмите один конец трубы полиэтиленовые резать автоклавного щипцы и слайд-трубки на иглу, пока не встречает хаба. Отрежьте трубку так, что примерно на 2 см выходит за кончик иглы. Удаление катетера из шприца и поместить в стерильную чашку Петри.
- Чтобы уменьшить вероятность перекрестного загрязнения, мы делаем один катетер для каждой мыши. В конце концов катетеров сделаны, стерилизовать их воздействием в раскрытый чашке Петри к ультрафиолетовому облучению, по крайней мере 30 минут. Не смотрите прямо на УФ-лампы или подвергать какой-либо части тела в капюшоне в то время как огни. После УФ-облучения, катетеры могут быть сохранены долгосрочный в чашке Петри. Мы рекомендуем уплотнения блюдо с парафильмом для поддержания стерильности.
II. Прививка животных
- Мыши должны прибыть по крайней мере за неделю до экспериментальных манипуляций, чтобы избежать стресс-индуцированного вмешивающиеся факторы. Женский мышей используются, потому что мужской уретры мыши крайне сложно катетеризации. CBA / J является широко используются, УТИ-восприимчивых инбредных штамм мыши. Мыши следует использовать от 8 до 12-недельного возраста, так как это окно иммунологической зрелости до старения. В первый день эксперимента, опустите конец стерильной прививки цикла в пробирку замороженных бактериальных акций. Собрать небольшой материалом, а полоса на соответствующие пластины агара. Как правило, уропатогенных E. палочка (УПЭК), а также другие штаммы могут быть выращены на ночь на Лурия-Бертани (LB) агаре при 37 ° С в окружающем воздухе. УПЭК штаммы растут в виде твердых, желтовато-белые полупрозрачные колонии на LB агар. Немедленно вернуть бактериальных акции морозильнике. Уропатогенных штаммов бактерий может стать менее вирулентным течением времени при повторных, серийный культур. Таким образом, мы рекомендуем полос из свежих пластины агара для каждого эксперимента.
- На 2-й день эксперимента, после подтверждения надлежащего морфологии колонии, выбрать одну из колоний агаром и место, по крайней мере, 5 мл бульона культуры в одночасье. Л. Б. бульон может быть использован для большинства уропатогенных штаммов бактерий (37 ° С, 200 оборотов в минуту в атмосферный воздух). Держите шапки разрешишь на трубах бульон культуры, чтобы аэрации.
- На 3-й день эксперимента, возьмите 10% от первого культуральной жидкости и культуры в бульон снова в течение ночи (обычно 37 ° C и 200 оборотов в минуту), в целях повышения типа я пили выражения. Последовательный культур бульон поможет оптимизировать бактериальных uropathogenicity, так как типа я пили Было показано, что одним из решающих факторов вирулентности уропатогенов в естественных условиях 1. Держите шапки разрешишь на трубах бульон культуры, чтобы аэрации.
- На 4-й день эксперимента, измерять OD 600 из бульона культуры от 3-й день. Если еще не известны бактериального штамма проходит испытания, выполнить десять раз серийного разбавления покрытий в течение не менее 7 бревна (разведение осуществляется с PBS, культуры осуществляется на LB-агар, 37 ° С инкубации в течение ночи), чтобы определить отношения между OD 600 и КОЕ / мл. Как правило, диаметр 600 из 0,4-0,5 обычно соответствует 1-2х10 7 КОЕ на 50 мкл. Как только отношения между OD 600 и КОЕ / мл была определена, можно настроить бульон культуры OD 600, соответствующий желаемому КОЕ на мышь в 50 мкл PBS. Некоторые из них работают предположил, что прививка от 10 мкл, а не 50, приводит к уменьшению рефлюкса в kidneys6. Тем не менее, большинство публикаций сообщили использование 50 мкл на мышь. Как правило, желаемый КОЕ колеблется в пределах от 10 6 и 108 КОЕ / мышь, но каждая бактериальная / мышь напряжение комбинация должна быть эмпирически испытания в естественных условиях.
- Чтобы убедиться, что инокулята не аннулируется сразу после закапывания, мыши должны быть лишены воды в течение 30 минут до индукции общей анестезии. Еще одной ключевой маневр, чтобы вызвать мочеиспускания до индукции анестезии scruffing мышей и слегка нажав нижнюю abdomеп. От двух до 2,5% изофлуран является безопасной дозой индукции в течение 8-12 недель старых самок мышей СВА, а затем поддержание анестезии с 1.8-2% изофлуран.
- После анестезии достигается, мыши находятся в положении лежа на спине с головой вставляется в головная часть связана с изофлуран содержащих кислород. Нижней части живота массируют эвакуировать мочу из мочевого пузыря. Если мочевой пузырь относительно пустой, этот маневр не может дать мочу. Нижней части живота и промежности пропитана 70% этанола.
- Стерильный 1 мл шприца без иглы используется для рисования до желаемого бактериальных посевной. Далее, стерильные уретральный катетер асептически размещены на шприц. Избыток трубки отрезается катетер с ножницами так, что только 1-2 миллиметров труб остаются дистальнее кончике иглы. Затем шприц постучал и поршень с депрессией шприц вертикально, чтобы удалить все пузырьки. Ложкой бактериостатическое смазочных желе брызгала на стерильную чашку Петри или внутри стерильного шприца обертку. Кончике катетера (с прикрепленными шприц) опускают в желе. Если несколько штаммов бактерий проходят испытания в одном эксперименте, будьте осторожны, чтобы не использовать те же самые капли желе для смазывания катетеров, содержащих различные штаммы.
- Использование стерео микроскопа (0,8 х до 5х зумом) для увеличения, клиторальный капюшон из наркоза мышь мягко схватил в недоминирующих руку с парой мелкими зубьями щипцами и поднял краниально раскрыть глубокий розовый уретры прохода ( Рисунок 1). Шприц (с прикрепленными катетер) захватывается в доминирующую руку с карандашом сцепление и кончике катетера занимается уретры прохода на 45 градусов. Клиторальный капюшон вытянут вдоль длинной оси шприца, эффективно "нагрузку" на уретру катетер. Этот маневр имеет важное значение, поскольку мышь уретры является излишним. Катетер должен легко скользить в мочевой пузырь (до центра, рисунок 2), и может быть слегка закрученный, чтобы помочь ориентироваться в избыточной складки уретры. Как только катетер hubbed, шприц может быть снижена, пока не будет параллельно длинной оси мыши. Не доминантной рукой может упасть щипцы, чтобы помочь стабилизировать положение катетера и шприца в качестве доминирующей рука используется, чтобы медленно вводят посевной (не менее 5 секунд). Если жидкость течет видел вокруг катетера во время инъекции, либо мочевой пузырь полон или катетер во влагалище (только каудально уретры). Инъекция должна быть немедленно остановлена и положение катетера тщательно изучены. Если катетер в мочеиспускательный канал, данная мышь не должна включаться в эксперимент. С другой стороны, катетер неуместны во влагалище, могут быть повторно и инъекции повторно пытались. После инъекции катетер и шприц медленно снят с мышью.
- Чтобы уменьшить вероятность раннего после инокуляции мочеиспускания, которые могут эвакуировать вводить бактерий и тем самым привести к разным уровнем инфекции, некоторые исследователи поддерживают мыши под анестезией в течение 30 минут после трансуретральной inoculation10. После операции, мыши должны восстановить на чистое одеяло потепления с непрерывным наблюдением, чтобы подтвердить возвращение нормальной структуре дыхание и деятельность. Как только животные полностью выздоровели способность ползать, они могут быть возвращены в кроватях-содержащих клеток.
III. Измерение КОЕ в инфицированной ткани
- Различные мыши ИМП публикации сообщалось о культуре результаты от 6 часов до одной недели и более после заражения. Оптимальные моменты времени должны быть определены эмпирически для каждого бактериального / мышь напряжение комбинации. Мочи получен для культуры scruffing мыши на стерильную чашку Петри. Сборник мочи должны храниться на льду во все времена. Многочисленные попытки получить мочи в течение многих часов может быть необходимым, так как мышь мочеиспускание становится частым, малого объема (30-100 мкл за пустым), и стресс-зависимыми.
- После получения аннулированы образцов мочи, мы жертвуем мышах изофлуран и цервикальной дислокации. Живот асептически открыт. Если образец мочи не была успешно получена ранее, небольшое количество мочи часто может быть атмосферный через стенку мочевого пузыря использованием 30 иглой и шприцем.
- Одна или обе почки удаляют, фарш по крайней мере на 4 части (каждая часть должна быть не менее 50 мкг) в стерильную чашку Петри, и помещают в шарик циркония / ПБС-содержащих криопробирки на льду. Мочевой пузырь удален, фарш по крайней мере на 4 части, и помещают в шарик из нержавеющей стали / ПБС-содержащих криопробирки на льду. Ткани / гранулы / ПБС-содержащих криопробирки помещаются в Пули Blender гомогенизатор и тканей гомогенизированный использовании "8" настройки скорости в течение одной минуты. Она является общей для некоторых фрагментов тканей остаться после гомогенизации. Пока 50-100 мкл жидкости гомогената можно пипеткой, твердые фрагментыне обязательно проблема. Если гомогенизации при увеличении времени для некоторых образцов, очень важно сделать это для всех тканей, с тем чтобы обеспечить согласованность гомогенизации. Мы используем Пуля Blender гомогенизатор, поскольку она исключает возможность перекрестного загрязнения, происходит быстрее, чем обработка отдельных образцов один за другим с использованием стандартного гомогенизатор, и не оказывает существенного тепла образцов, гомогенизации.
- По крайней мере, два или три десятикратное разведение собранной мочи и тканей гомогенатах должны быть сделаны в планшет. Для предварительных экспериментах было бы благоразумно, чтобы по крайней мере семь десять раз разведений. Культуры до 100 мкл мочи, мочевой пузырь, и / или почек гомогенатах на соответствующих агара. Так как образцы мочи могут быть объем ограничен, это может быть необходимо довести их объемы до 100 мкл до выполнения десятикратном разведении. Если это необходимо, начального разбавления (до десятикратного разведения) должны быть учтены в окончательных расчетов бактериальных урожайности. Мы предпочитаем культивирования УПЭК по-эозином метиленовым синим или МакКонки агар (ночной инкубации при температуре 37 ° С), так как эти средства массовой информации являются селективными для грамотрицательных микроорганизмов. УПЭК штаммы растут на агаре МакКонки как централизованно пупковидным вдавлением, красно-розовые колонии из-за их способности фермента лактозы.
- После ночной культуры, граф КОЕ для каждой пластины. Для серийно разбавленных образцах, пластины разведения содержащих 50-100 колоний считается наиболее точный подсчет. «Назад» рассчитывать КОЕ на ткани, на миллиграмм ткани, или на мл.
IV. Представитель Результаты
Рисунок 1. Уретры прохода (темно-розовая ткань), предоставляемые подъема клиторальный капюшон краниально щипцами (за пределами верхней части фото)
Рисунок 2. Катетеризация уретры. Бифидо клитора можно увидеть чуть выше катетер.
Рисунок 3. Мочевого пузыря КОЕ рассчитывает через 2 дня после трансуретральной заражения 8 недель девочка CBA / J мышей с уропатогенных E. палочки. Пузыри гомогенизировали и КОЕ / мл определяется по серийному покрытие разведения на агаре МакКонки. Алмазы показывают, КОЕ / мл для отдельных мышей, горизонтальная полоса указывает на средний КОЕ / мл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Индукция мыши инфекции мочевыводящих путей с помощью трансуретральной инокуляции бактерий давние, но технически сложная процедура 11. Хунг и Hultgren недавно опубликовал прекрасный обзор трансуретральной техники мыши инфекции мочевыводящих путей 13. В этой статье мы попытаемся проиллюстрировать тонкости этого экспериментального подхода.
Новички могут практиковать свою технику, выполняя срединной лапаротомии выявить мочевого пузыря, потребители инъекционных разбавленного раствора тушь (1% в PBS), и наблюдая за синей окраски мочевого пузыря. Мы обнаружили, что полный мочевой пузырь является одним из самых сложных проблем для рассмотрения во время инъекции мыши уретры, и лучше предотвратить, лишение воды и предварительной анестезии мочеиспускания стратегии, описанные выше. В наших руках, <10% мышей выставку переполнения мочи во время уретры инъекции. Еще одним потенциальным камнем преткновения является травматическим катетеризации, что может привести к перфорации уретры, неправильные дозы инокулята мочевого пузыря, и даже гибель животных. Нежный техники и терпение являются ключевыми при катетеризации; успешной катетеризации никогда не должен требовать заставляя катетера в мочевой пузырь.
Наконец, некоторые лаборатории не можете использовать пули Blender гомогенизатора или других «средних пропускная способность" гомогенизатора, либо из-за небольшого числа проб или стоимости. Промежуточным решением является использование стандартного гомогенизатор и чистой устройство между каждой пробе. Наиболее экономичным решением является использование стекла шлифовальные машины, которые мы успешно применяется до перехода на Пуля Blender гомогенизатора. Независимо от метода гомогенизации ткани используется, дотошный, асептические, и последовательная методика имеют решающее значение для получения воспроизводимых результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Шелли Се и Дженнифер Payne для их экспертной технической помощи. Эта работа стала возможной благодаря грантам от общества детской урологии и исследований Стэнфордского детской фонд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps) | E&K Scientific | 640201 | |
| Caps for cryovial tubes, with ’O’ ring | E&K Scientific | 440011-N | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Zirconium Oxide Beads (0.5mm) | Next Advance | ZROB05 | |
| Stainless Steel Beads (1.6mm) | Next Advance | SSB16 | |
| Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm) | Next Advance | SSB14B | |
| CBA/J Mice, 8-12 week old female | Jackson Laboratory | 000656 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM) | EMD Millipore | EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4) | |
| LB agar | |||
| LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-601 | |
| Eosin-methylene blue (EMB) agar powder | Himedia Laboratories | MM022-500G | |
| MacConkey agar powder | Difco Laboratories | 212123 | |
| LB agar powder | Difco Laboratories | 244520 | |
| Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)] | BD Biosciences | 427401 | |
| 30 gauge needles, 1/2 inch | BD Biosciences | 305106 | |
| 1 ml tuberculin Slip-Tip syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3 ml Luer-Lock syringe | BD Biosciences | 309585 |
References
- Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice. Infect Immun. 55, 373-380 (1987).
- Rouschop, K. M. Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract. J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).
- Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli. Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).
- Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).
- Hvidberg, H. Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies. Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).
- Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).
- Gunther, N. W. t, Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection. Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).
- Bishop, B. L. Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells. Nat Med. 13, 625-630 (2007).
- Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).
- Hagberg, L. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Infect Immun. 40, 273-283 (1983).
- Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).
