Summary
Este video se muestran los métodos para inducir transuretral infecciones del tracto urinario ratón y cuantificar la extensión de las infecciones resultantes.
Abstract
Cepas bacterianas uropatógena de interés se cultivan en agar. En general, los uropatógenos
Protocol
I. Preparación de sondas uretrales
- Para cada uno de vejiga y los riñones del ratón para el muestreo, lugar 5-6 gotas de acero inoxidable (vejiga, el tamaño de 1,6 mm o de 0,9 a 2,0 mm mezcla) o granos de óxido de circonio (de los riñones, el tamaño de 0,5 mm) en un tubo de criovial, respectivamente. Autoclave de los tubos de cuentas que contienen.
- Después de los tubos de enfriar a temperatura ambiente, añadir 200 microlitros de PBS estéril a cada cordón de acero inoxidable que contiene el tubo y 400 microlitros de PBS estéril a cada grano de óxido de zirconio que contiene el tubo.
- Preparamos sondas uretrales según lo descrito por Hung y Hultgren 13. Autoclave un par limpio de cabeza plana de pinzas y tijeras finas (iris o similar) y permitir que los instrumentos que se enfríe a temperatura ambiente. Limpie las superficies de una campana de flujo laminar con etanol al 70%. En la capilla, un corte de 30 cm (aproximado) del segmento de tubería de polietileno. Asépticamente a cabo una aguja de calibre 30 estéril (la aguja larga 1 / 2 pulgada) en una jeringa estéril de 3. Levante un extremo de la tubería de polietileno cortada con la pinza en autoclave y deslice el tubo en la aguja hasta que se encuentra el centro. Cortar el tubo a fin de que aproximadamente 2 cm se extiende más allá de la punta de la aguja. Retirar el catéter de la jeringa y coloque en un plato de Petri estériles.
- Para reducir la probabilidad de contaminación cruzada, hacemos un catéter para cada ratón. Después de todos los catéteres se hacen, esterilizarlos por la exposición en una placa de Petri descubrió que la radiación UV por lo menos durante 30 minutos. No mire directamente a las lámparas UV o exponer cualquier parte del cuerpo en la capilla mientras que las lámparas se activan. Después de la exposición UV, los catéteres se pueden almacenar a largo plazo en la placa de Petri. Se recomienda sellar el plato con Parafilm para ayudar a mantener la esterilidad.
II. La inoculación de los animales
- Los ratones deben llegar por lo menos una semana antes de la manipulación experimental con el fin de evitar la tensión inducida por factores de confusión. Los ratones hembra que se utilizan debido a que la uretra ratón macho es extremadamente difícil para la cateterización. CBA / J es un comúnmente utilizados, UTI-susceptibles cepa de ratones endogámicos. Los ratones se debe utilizar entre 8 y 12 semanas de edad, ya que esta es la ventana de la madurez inmunológica antes de la senescencia. En el primer día del experimento, sumergir el extremo de un lazo de inoculación estéril en un vial de las acciones de bacterias congeladas. Raspar un inóculo pequeño y fuera racha en una placa de agar apropiado. En general, los uropatógenos E. coli (UPEC) y otras cepas pueden ser cultivadas durante la noche en Luria-Bertani (LB) de agar a 37 ° C en el aire ambiente. Cepas UPEC crecer como sólida, de color blanco amarillento colonias translúcidas en agar LB. De inmediato a la acción bacteriana en el congelador. Cepas de uropatógenos bacteriana puede llegar a ser menos virulento en el tiempo con cultivos repetidos en serie. Por lo tanto, se recomienda en estrías, una placa de agar fresco para cada experimento.
- El día 2 del experimento, después de confirmar morfología de las colonias adecuada, elegir una sola de las colonias de las placas de agar y el lugar por lo menos en 5 cc de caldo de cultivo durante la noche. Caldo de LB se pueden utilizar para la mayoría de las cepas de uropatógenos bacteriana (37 ° C, 200 rpm en el aire ambiente). Mantenga las tapas sueltas en los tubos de caldo de cultivo para permitir la aireación.
- El día 3 del experimento, tienen el 10% de caldo de cultivo primera y la cultura en el caldo de nuevo durante la noche (normalmente 37 º C y 200 rpm), para mejorar la expresión de tipo I pili. Los cultivos seriados de caldo de ayudar a optimizar uropathogenicity bacteriana, ya que el tipo I pili han demostrado ser un factor de virulencia crítica para los uropatógenos en vivo 1. Mantenga las tapas sueltas en los tubos de caldo de cultivo para permitir la aireación.
- El día 4 del experimento, medir el diámetro exterior de 600 de caldo de cultivo a partir del día 3. Si no es ya conocido por la cepa bacteriana que se prueba, realizar diez veces dilución en placas en serie en al menos 7 registros (diluciones realizadas con PBS, cultivos realizados en agar LB, de 37 ° C de incubación durante la noche) para determinar la relación entre el OD y 600 ufc / ml. Como regla general, una OD 600 de 0,4-0,5 comúnmente corresponde al 1-2x10 7 ufc por 50 microlitros. Una vez que la relación entre el OD y 600 ufc / ml ha sido determinada, se puede ajustar el caldo de cultivo para el OD 600 correspondiente a la ufc deseada por ratón en 50 microlitros de PBS. Algunos trabajos han sugerido que la inoculación de 10 microlitros, en lugar de 50, lleva a un menor de reflujo en el kidneys6. Sin embargo, la mayoría de las publicaciones han reportado el uso de 50 microlitros por ratón. En general, los rangos de ufc deseado entre 10 6 y 108 ufc / ratón, pero cada combinación de la cepa bacteriana / ratón debe ser probado empíricamente en vivo.
- Para ayudar a asegurar que inóculos no se anulan inmediatamente después de la instilación, los ratones deben ser privados de agua durante por lo menos 30 minutos antes de la inducción de la anestesia general. Otra maniobra clave para inducir la evacuación antes de la inducción de la anestesia por scruffing ratones y presionando suavemente el abdom menoren. Dos a un 2,5% isoflurano es una dosis de inducción segura por 8-12 semanas de edad, los ratones hembra CBA, seguido de mantenimiento de la anestesia con isoflurano 1,8-2%.
- Una vez que la anestesia se logra, los ratones se colocan en posición de decúbito supino con la cabeza insertada en una ojiva conectado a isoflurano que contienen oxígeno. La parte inferior del abdomen es un masaje para evacuar la orina desde la vejiga. Si la vejiga está relativamente vacío, esta maniobra no puede producir orina. La parte inferior del abdomen y el perineo está empapado con etanol al 70%.
- Un estéril jeringa de 1 cc sin aguja se utiliza para la elaboración del inóculo deseado bacteriana. A continuación, un catéter uretral estéril asépticamente colocada en la jeringa. El exceso de tubo se corta el catéter con un par de tijeras para que sólo 2.1 milímetros de tubería de permanecer distal a la punta de la aguja. Entonces, la jeringa se aprovecha y el émbolo de la depresión con la jeringa en posición vertical para eliminar todas las burbujas. Una cucharada de jalea lubricante bacteriostático se roció sobre una placa de Petri estéril o en el interior de la envoltura jeringa estéril. La punta del catéter (con jeringa adjunta) se sumerge en la jalea. Si hay varias cepas de bacterias se están probando en el mismo experimento, tenga cuidado de no utilizar la misma gota de jalea para lubricar los catéteres que contienen diferentes cepas.
- El uso de un microscopio estereoscópico (0.8x de zoom 5x) para la ampliación, la capucha del clítoris con el ratón anestesiado con suavidad, tomado en la mano no dominante con un par de pinzas de dientes finos y se crió cefálica para exponer el meato uretral profundidad de color rosa ( Figura 1). La jeringa (con sonda conectada) se sujeta en la mano dominante, con un agarre lápiz y la punta del catéter está involucrado en el meato uretral en un ángulo de 45 grados. La capucha del clítoris está extendida a lo largo del eje longitudinal de la jeringa, con eficacia "carga" de la uretra en el catéter. Esta maniobra es esencial, ya que la uretra del ratón es redundante. El catéter debe introducirse con facilidad en la vejiga (hasta el centro, la figura 2), y se puede girar suavemente para ayudar a navegar los pliegues redundantes de la uretra. Una vez que el catéter se hubbed, la jeringa se puede reducir hasta que quede paralela al eje largo del mouse. La mano no dominante puede dejar las pinzas para ayudar a estabilizar la posición del catéter y la jeringa en la mano dominante se utiliza para inyectar lentamente el inóculo (por lo menos 5 segundos). Si el líquido se ve que fluye alrededor de la sonda durante la inyección, ya sea que la vejiga está llena o el catéter está en la vagina (justo caudal a la uretra). La inyección debe detenerse inmediatamente y la posición del catéter cuidadosamente examinada. Si el catéter se encontraba en la uretra, el ratón dado no deben ser incluidos en el experimento. Por otro lado, un catéter mal colocado en la vagina puede cambiar de posición y la reinyección intento. Después de la inyección, el catéter y la jeringa se retira lentamente desde el ratón.
- Para reducir la probabilidad de los primeros después de la inoculación la micción, lo cual puede evacuar a las bacterias administrada y por lo tanto llevar a los niveles de infección variables, algunos investigadores mantienen los ratones bajo anestesia durante 30 minutos después transuretral inoculation10. Después de la cirugía, los ratones se recuperará en una manta térmica limpia con la observación continua para confirmar cambio de los patrones de respiración y la actividad normal. Una vez que los animales se han recuperado totalmente la capacidad de arrastre, que pueden ser devueltos a las camas-jaulas que contienen.
III. UFC medir en el tejido infectado
- Diversas publicaciones del ratón IU han informado sobre los resultados del cultivo de 6 horas a una semana o más después de la inoculación. Los puntos de tiempo óptimo necesario determinar empíricamente para cada combinación de cepas bacterianas / ratón. Orina evacuada se obtiene de la cultura por scruffing ratón sobre una placa de Petri estéril. Orina recolectada debe mantenerse en hielo en todo momento. Múltiples intentos para obtener orina evacuada durante varias horas puede ser necesaria, ya que la micción frecuente del ratón es el volumen, baja (30 a 100 microlitros por vacío), y el estrés-dependiente.
- Después de la obtención de muestras de orina anulado, sacrificamos los ratones por dislocación cervical y el isoflurano. El abdomen está abierto asépticamente. Si la muestra de orina evacuada, no se obtiene con éxito antes, una pequeña cantidad de orina a menudo pueden ser aspiradas a través de la pared de la vejiga usando una aguja de calibre 30 y una jeringa.
- Uno o ambos riñones se eliminan, picada en al menos 4 piezas (cada pieza debe ser inferior a 50 microgramos) en una placa de Petri estéril, y se coloca en circonio de cuentas / PBS que contiene crioviales en el hielo. Se extirpa la vejiga, picada en al menos 4 piezas, y se coloca en acero inoxidable de grano / PBS que contiene crioviales en el hielo. El tejido / grano / PBS que contiene crioviales se colocan en una bala Blender homogeneizador y los tejidos se homogeneizan con el "8" ajuste de la velocidad durante un minuto. Es común que algunos fragmentos de tejido a permanecer después de la homogeneización. Mientras 50-100 microlitros de líquido homogeneizado puede ser una pipeta, fragmentos sólidosno son necesariamente un problema. Si el tiempo es mayor homogeneización de algunos ejemplos, es muy importante hacerlo para todos los tejidos con el fin de mantener la coherencia de la homogeneización. Utilizamos una bala Blender homogeneizador, ya que evita la posibilidad de contaminación cruzada, es más rápido que el procesamiento de muestras individuales, uno por uno usando un homogeneizador estándar, y no de manera significativa el calor de las muestras se homogeneizaron.
- Por lo menos dos o tres de diez diluciones de la orina recolectada y homogeneizados de tejido debe ser hecho en una placa de microtitulación. Para los experimentos preliminares, puede ser prudente para que al menos siete de diez diluciones. La cultura hasta 100 microlitros de la orina, la vejiga y / o homogeneizados renales en agar apropiado. Dado que las muestras de orina puede ser de volumen limitado, puede ser necesario para que sus volúmenes de 100 microlitros antes de realizar diez diluciones. Si esto es necesario, la dilución inicial (antes de las diez veces dilución) tendrá que tenerse en cuenta en los cálculos finales de los rendimientos de las bacterias. Nosotros preferimos el cultivo de la UPEC en el azul de metileno o eosina-agar MacConkey (una noche de incubación a 37 ° C), ya que estos medios son selectivos para los microorganismos gramnegativos. Cepas UPEC crecen en agar MacConkey como centro umbilicadas, de color rojo-rosado colonias debido a su capacidad de fermentar la lactosa.
- Después del cultivo durante la noche, contar con la UFC por cada plato. Para las muestras diluido en serie, la dilución de la placa que contiene 50 a 100 colonias se considera los resultados más exactos. "Volver" calcular ufc por los tejidos, por miligramo de tejido, o por ml.
IV. Resultados representante
Figura 1. Meato uretral (tejido de color rosa oscuro) expuesta por el levantamiento de capuchón del clítoris cefálica con fórceps (más allá de la parte superior de la foto)
Figura 2. Sondaje uretra. El clítoris bífido se puede ver justo por encima de la sonda.
Figura 3. Vejiga ufc cuenta dos días después de la infección transuretral de 8 semanas de edad CBA / J ratones con uropatógenos E. coli. Vejigas se homogeneizaron y se determinó ufc / ml mediante siembra de diluciones en serie en agar MacConkey. Diamantes indican ufc / ml en los ratones individual, barra horizontal indica la mediana ufc / ml.
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Discussion
La inducción de la infección del tracto urinario del ratón mediante la inoculación de bacterias transuretral es un procedimiento de larga data, pero técnicamente exigente 11. Colgado y Hultgren ha publicado recientemente una excelente revisión de las técnicas transuretral de infección del tracto urinario del ratón 13. En este trabajo, se intenta ilustrar los puntos más importantes de este enfoque experimental.
Los principiantes pueden practicar su técnica mediante la realización de una laparotomía media para exponer la vejiga, la inyección de una solución diluida de tinta china (1% en PBS), y la observación de la coloración azul de la vejiga. Hemos encontrado que la vejiga llena es uno de los problemas más difíciles de manejar durante la inyección del ratón la uretra, y se puede prevenir con la privación de agua y pre-anestesia estrategias de evacuación descrito anteriormente. En nuestras manos, <10% de los ratones muestran desbordamiento de la orina durante la inyección uretral. Otro obstáculo potencial es la cateterización traumática, que puede conducir a la perforación uretral, las dosis inadecuada de los inóculos de vejiga, e incluso la muerte de los animales. Técnica suave y la paciencia son la clave durante el cateterismo; cateterismo éxito no debe pedir nunca forzar el catéter en la vejiga.
Por último, algunos laboratorios no desea utilizar una bala Blender homogeneizador o "rendimiento medio" homogeneizador, ya sea por el número de muestras de baja o consideraciones de costo. Una solución intermedia es utilizar un homogeneizador estándar y limpiar el aparato entre cada muestra. La solución más económica es el uso de molinos de vidrio, que con éxito antes de cambiar a la bala Blender homogeneizador. Independientemente del método de homogeneización del tejido utilizado, una técnica meticulosa, aséptica, y consistente son cruciales para obtener resultados reproducibles.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Shelly Xie y Jennifer Payne por su asistencia técnica de expertos. Este trabajo fue posible gracias a donaciones de la Sociedad de Urología Pediátrica y el Fondo de Stanford Pediatric Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps) | E&K Scientific | 640201 | |
| Caps for cryovial tubes, with ’O’ ring | E&K Scientific | 440011-N | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Zirconium Oxide Beads (0.5mm) | Next Advance | ZROB05 | |
| Stainless Steel Beads (1.6mm) | Next Advance | SSB16 | |
| Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm) | Next Advance | SSB14B | |
| CBA/J Mice, 8-12 week old female | Jackson Laboratory | 000656 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM) | EMD Millipore | EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4) | |
| LB agar | |||
| LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-601 | |
| Eosin-methylene blue (EMB) agar powder | Himedia Laboratories | MM022-500G | |
| MacConkey agar powder | Difco Laboratories | 212123 | |
| LB agar powder | Difco Laboratories | 244520 | |
| Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)] | BD Biosciences | 427401 | |
| 30 gauge needles, 1/2 inch | BD Biosciences | 305106 | |
| 1 ml tuberculin Slip-Tip syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3 ml Luer-Lock syringe | BD Biosciences | 309585 |
References
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