גרורה ניסויית חיסוני CTL המאמצת העברת דגם עכבר

Summary

גרורות הריאה ניסיוניים מודל CTL עכבר חיסוני לניתוח האינטראקציה תאים סרטניים תא-T

Abstract

מודל ניסיוני עכבר גרורות גרורות הוא מודל פשוט עדיין רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. תאים סרטניים מוזרקים לווריד (iv) לתוך הוורידים זנב עכבר ליישב הריאות, ובכך, שמזכיר את הצעדים האחרונים של גרורות תאים סרטניים ספונטנית: הישרדות extravasation ההשאלה, והקולוניזציה באיברים דיסטלי. מבחינה טיפולית של נוף, מודל ניסיוני גרורות הוא הדגם הפשוט האידיאלי מאז היעד של טיפולים היא לעתים קרובות את נקודת הסיום של גרורות: גידול גרורתי הוקמה בשנת האיבר הדיסטלי. במודל זה, תאים סרטניים מוזרקים לתוך הוורידים iv העכבר הזנב מותר ליישב ולפתח את הריאות. גידול ספציפי ההרג מוזרקים אז iv לעכבר גרורות נושאות. המספר והגודל של גרורות הריאה ניתן לשלוט במספר תאים סרטניים להיות מוזרק והזמן של הגידול. לכן, בשלבים שונים של גרורות, גרורות מן מינימלית גרורות נרחב, יכול להיות המודל. גרורות הריאה מנותחים על ידי האינפלציה בדיו, ובכך מאפשר תצפית ויזואלית יותר קל וכימות.

Protocol

1. גרורה ניסויית עכבר דגם

1. ביום לפני זריקות תאים סרטניים, זרע אחד T75 עם בקבוק עד 1 x 10 ⁷ CMS4-Met תאים 10 מ"ל של מדיום RPMI המכילה 10% נסיוב להשיג בצמיחה מהירה תאים סרטניים. דגירה לילה בשעה 37 ° C.
2. ביום של הזריקה, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים פעם עם PBS, אז הקציר תאים סרטניים עם 0.05% טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. עצור את התגובה עם 10 מ"ל של מדיום RPMI סרום המכיל 10%. העברת התאים צינור חרוטי.
3. ספין למטה התאים ב 1300 סל"ד ב צנטריפוגה מקרא RT Sorvall 3 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant. Resuspend התאים טרי 10 מ"ל 1X HBSS לשטוף, אז ספין למטה שוב resuspend באותו אופן.
4. ספירת תאים סרטניים על hemocytometer. לדלל את התאים HBSS, כך התאים הדרושים כל הזרקה הם resuspended בנפח כולל של 100 μL.
5. חם 6-8 בן שבוע BALB / c עכברים בכוס שקוע במים חמים כדי להרחיב את הווריד הזנב. הנח את העכבר על עוצר זנב וריד על הספסל. השתמש microsyringe להזריק 100 μL של תאים סרטניים לווריד הזנב לרוחב. השתמש בטכניקה aseptic כדי למנוע זיהום. לאחר ההזרקה, להפעיל לחץ קל על הזריקה עד הדימום הפסיק.
6. החזר את העכבר בכלוב, ולאפשר הגידול לגדול לשלב הרצוי.

2. לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים (CTL) העברת המאמצת חיסוני

1. ביום ההעברה, פיפטה מעלה ומטה כדי resuspend ציטוטוקסיות מטוהרים לימפוציטים מסוג T, או ההרג, מוכן כמתואר בטקסט. העברת כל התאים מהצלחת אחד צינור חרוטי 15 מ"ל, לא נותנים נפח יעלה יותר מ 2 / 3 של הצינור.
2. הכנס סטרילי פסטר פיפטה לתוך הצינור חרוטי ולהניח בינוני ההפרדה לימפוציטים, או LSM, תחת התאים עד הנפח הכולל מתקרב 14 מ"ל.
3. היזהר שלא להפריע את השכבות. צנטריפוגה בסל"ד 2000 למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. אין להשתמש בבלם כדי להאט את הרוטור אחרי ספינינג.
4. מעבירים את ההרג על צינור חדש 15 מ"ל חרוטי. הוסף HBSS לנפח של כ -10 מ"ל לשטוף.
5. ספירת התאים. ספין למטה בסל"ד 1300 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend ב HBSS לצפיפות תא נדרש זריקות, תוך שמירה על הנפח הכולל לכל זריקה בבית μL 100.
6. שימוש באותה טכניקה הזרקת הזנב כפי שנראה קודם לכן סרטון זה להזריק את ההרג לתוך הגידול נושאות עכברים.
7. החזר את העכבר בכלוב, ולאפשר ההרג לקיים אינטראקציה עם הגידול. עכברים הם הקריבו בדרך כלל לניתוח 14-21 ימים לאחר הטיפול CTL.

3. ויזואליזציה של גרורות ריאות

1. כדי להמחיש גרורות ריאות, במקום עכבר הקריב על גבו על לוח קלקר. הצמד את הרגליים כדי להבטיח גישה בלא הפרעה לקנה הנשימה. תרסיס הצד הגחוני עם אתנול 70%.
2. החל מ הבטן באמצע, להשתמש במספריים לחתוך לאורך קו האמצע, דרך בית החזה, ואת לכיוון בלוטות הרוק. לחשוף את קנה הנשימה. שימוש במלקחיים כדי להסיר הרקמות הסובבות את הקנה.
3. נושא טיפ 200 פיפטה μL מתחת לקנה הנשימה. מחזיק את קצה ביד אחת, בעדינות להרים את קנה הנשימה מעלה מהגוף.
4. סובב את פלטפורמת 180 °. השתמש מזרק 50 מ"ל להזריק דיו הודו לריאות דרך קנה הנשימה. לגמרי לנפח את הריאות עם דיו עד שאתה מרגיש התנגדות חזקה.
5. השתמש מספריים כדי לחתוך את קנה הנשימה. Slide זוג מלקחיים תחת הריאות ולהרים אותם העכבר. שוטפים את הריאות בקצרה בכוס 1 ליטר של מים.
6. במנדף כימי קטר, להעביר את הריאות בקבוקון זכוכית scintillation המכיל 5 מ"ל של הפתרון של Fekete. רקמת הגידול תצא כמו גושים לבנים על הריאות שחור אחרי כמה דקות. גידולים יכולים כעת לסמוך ומאוחסנים הפתרון של Fekete ללא הגבלת זמן.

4. נציג גרורות בריאות דמיינו

1. הנה, הריאות מעכברים כי הוזרקו תאים החלב 4T1 קרצינומה קו להראות כתמים לבנים המעידים גידולים. עכברים הוזרקו תאים 4T1 transfected עם K79E דומיננטי שלילי IRF8 מוטציה להראות את הפוטנציאל גרורתי מוגברת של תאים סרטניים.
2. תמונות אלו מראות ניתוח היסטולוגית של יעילות חיסוני CTL העברת המאמצת. גידול נושאות עכברים שהוזרק עם מלוחים הראו גידולים מרובים 6 ימים לאחר מכן, שמסומן על ידי חיצים צהובים (A). עכברים שהוזרק עם גידול ספציפי בתאי T, לעומת זאת, הראה ירידה של גידולים (B).
3. בניסוי דומה, טיפול הודו דיו נותן דרך פשוטה למדוד את היעילות של העברת המאמצת CTL. כאן, גושים סרטניים לבן על נושאות גידולים הריאות הבחנה ברורה להם מהריאות שעברו בהצלחה העברת המאמצת CTL, וספירת גושים מאפשר לתוארשל quantitation לא אפשרי עם היסטולוגיה.

5. נציג תוצאות

באיור 1. תכנית ניסיונית עבור גרורות הגידול ניסיוניים CTL חיסוני אדפטיבית העברת במודל עכבר. נקודות אדומות מצביעות תאים סרטניים נקודות ירוק עולה ההרג.

איור 2. שיבוש של תפקוד משופר IRF8 פוטנציאל גרורתי של תאים סרטניים. עכבר החלב קרצינומה 4T1 הקו היה transfected ביציבות עם וקטור (4T1.Vector) או וקטור הבעת IRF8 דומיננטי שלילי מוטציה K79E (4T1.IRF8K79E) (15, 16). תאים סרטניים הוזרקו לתוך ורידים iv העכבר הזנב לרוחב. גידול נושאות הריאות היו מנופחים עם דיו הודו לדמיין גושים סרטניים. גושים גידול נתפסים בקלות כמו כתמים לבנים על רקע שחור רקמת הריאות.

איור 3. ניתוח היסטולוגית של יעילות חיסוני CTL העברת המאמצת. סרקומה עכבר התא קו CMS4-Met שהוזרק לתוך הוורידים iv העכבר לרוחב הזנב. שלושה ימים לאחר מכן, מלוחים (א) או גידולים מסוימים בתאי T (B) הוזרקו נושאות גידולים בעכברים. ריאות נותחו שישה ימים לאחר הטיפול על ידי CTL מכתים H & E המקובלת היסטולוגית. גושים גידול מסומנים על ידי חצים.

איור 4. ויזואליזציה של גושים הגידול באינפלציה דיו בהודו. סרקומה עכבר התא קו CMS4-Met שהוזרק לתוך הוורידים iv העכבר לרוחב הזנב. שלושה ימים לאחר מכן, מלוחים (Control) או גידולים מסוימים בתאי T (+ CTL) הוזרקו נושאות גידולים בעכברים. ריאות נותחו ארבעה עשר ימים לאחר הטיפול CTL. כתמים לבנים, אשר הם גושים סרטניים, לאפשר כימות קל של יעילות הטיפול CTL.

Materials

Solutions:

India Ink Solution (17):

Pour 150 ml of distilled water into a 250 ml flask. Add 4 drops ammonium hydroxide to the distilled water. Add 30 ml India Ink stock (i.e. Sanford Black Magic Waterproof Drawing Ink 4465 Item 44011) to the ammonia and water mixture. Top off with distilled water to a volume of 200 ml. Solution is ready for injection.

Fekete's Solution (17):

Fekete's solution is used to bleach India ink-inflated tumor-bearing lungs to distinguish white tumor nodules from the black background of normal tissues.

Add 350ml 95% EtOH to 1L glass bottle. Add 150ml distilled water Add 50ml formaldehyde Add 25ml glacial acidic acid