Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

גרורה ניסויית חיסוני CTL המאמצת העברת דגם עכבר

doi: 10.3791/2077 Published: November 26, 2010
* These authors contributed equally

Summary

גרורות הריאה ניסיוניים מודל CTL עכבר חיסוני לניתוח האינטראקציה תאים סרטניים תא-T

Abstract

מודל ניסיוני עכבר גרורות גרורות הוא מודל פשוט עדיין רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. תאים סרטניים מוזרקים לווריד (iv) לתוך הוורידים זנב עכבר ליישב הריאות, ובכך, שמזכיר את הצעדים האחרונים של גרורות תאים סרטניים ספונטנית: הישרדות extravasation ההשאלה, והקולוניזציה באיברים דיסטלי. מבחינה טיפולית של נוף, מודל ניסיוני גרורות הוא הדגם הפשוט האידיאלי מאז היעד של טיפולים היא לעתים קרובות את נקודת הסיום של גרורות: גידול גרורתי הוקמה בשנת האיבר הדיסטלי. במודל זה, תאים סרטניים מוזרקים לתוך הוורידים iv העכבר הזנב מותר ליישב ולפתח את הריאות. גידול ספציפי ההרג מוזרקים אז iv לעכבר גרורות נושאות. המספר והגודל של גרורות הריאה ניתן לשלוט במספר תאים סרטניים להיות מוזרק והזמן של הגידול. לכן, בשלבים שונים של גרורות, גרורות מן מינימלית גרורות נרחב, יכול להיות המודל. גרורות הריאה מנותחים על ידי האינפלציה בדיו, ובכך מאפשר תצפית ויזואלית יותר קל וכימות.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. גרורה ניסויית עכבר דגם

  1. ביום לפני זריקות תאים סרטניים, זרע אחד T75 עם בקבוק עד 1 x 10 7 CMS4-Met תאים 10 מ"ל של מדיום RPMI המכילה 10% נסיוב להשיג בצמיחה מהירה תאים סרטניים. דגירה לילה בשעה 37 ° C.
  2. ביום של הזריקה, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים פעם עם PBS, אז הקציר תאים סרטניים עם 0.05% טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. עצור את התגובה עם 10 מ"ל של מדיום RPMI סרום המכיל 10%. העברת התאים צינור חרוטי.
  3. ספין למטה התאים ב 1300 סל"ד ב צנטריפוגה מקרא RT Sorvall 3 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant. Resuspend התאים טרי 10 מ"ל 1X HBSS לשטוף, אז ספין למטה שוב resuspend באותו אופן.
  4. ספירת תאים סרטניים על hemocytometer. לדלל את התאים HBSS, כך התאים הדרושים כל הזרקה הם resuspended בנפח כולל של 100 μL.
  5. חם 6-8 בן שבוע BALB / c עכברים בכוס שקוע במים חמים כדי להרחיב את הווריד הזנב. הנח את העכבר על עוצר זנב וריד על הספסל. השתמש microsyringe להזריק 100 μL של תאים סרטניים לווריד הזנב לרוחב. השתמש בטכניקה aseptic כדי למנוע זיהום. לאחר ההזרקה, להפעיל לחץ קל על הזריקה עד הדימום הפסיק.
  6. החזר את העכבר בכלוב, ולאפשר הגידול לגדול לשלב הרצוי.

2. לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים (CTL) העברת המאמצת חיסוני

  1. ביום ההעברה, פיפטה מעלה ומטה כדי resuspend ציטוטוקסיות מטוהרים לימפוציטים מסוג T, או ההרג, מוכן כמתואר בטקסט. העברת כל התאים מהצלחת אחד צינור חרוטי 15 מ"ל, לא נותנים נפח יעלה יותר מ 2 / 3 של הצינור.
  2. הכנס סטרילי פסטר פיפטה לתוך הצינור חרוטי ולהניח בינוני ההפרדה לימפוציטים, או LSM, תחת התאים עד הנפח הכולל מתקרב 14 מ"ל.
  3. היזהר שלא להפריע את השכבות. צנטריפוגה בסל"ד 2000 למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. אין להשתמש בבלם כדי להאט את הרוטור אחרי ספינינג.
  4. מעבירים את ההרג על צינור חדש 15 מ"ל חרוטי. הוסף HBSS לנפח של כ -10 מ"ל לשטוף.
  5. ספירת התאים. ספין למטה בסל"ד 1300 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend ב HBSS לצפיפות תא נדרש זריקות, תוך שמירה על הנפח הכולל לכל זריקה בבית μL 100.
  6. שימוש באותה טכניקה הזרקת הזנב כפי שנראה קודם לכן סרטון זה להזריק את ההרג לתוך הגידול נושאות עכברים.
  7. החזר את העכבר בכלוב, ולאפשר ההרג לקיים אינטראקציה עם הגידול. עכברים הם הקריבו בדרך כלל לניתוח 14-21 ימים לאחר הטיפול CTL.

3. ויזואליזציה של גרורות ריאות

  1. כדי להמחיש גרורות ריאות, במקום עכבר הקריב על גבו על לוח קלקר. הצמד את הרגליים כדי להבטיח גישה בלא הפרעה לקנה הנשימה. תרסיס הצד הגחוני עם אתנול 70%.
  2. החל מ הבטן באמצע, להשתמש במספריים לחתוך לאורך קו האמצע, דרך בית החזה, ואת לכיוון בלוטות הרוק. לחשוף את קנה הנשימה. שימוש במלקחיים כדי להסיר הרקמות הסובבות את הקנה.
  3. נושא טיפ 200 פיפטה μL מתחת לקנה הנשימה. מחזיק את קצה ביד אחת, בעדינות להרים את קנה הנשימה מעלה מהגוף.
  4. סובב את פלטפורמת 180 °. השתמש מזרק 50 מ"ל להזריק דיו הודו לריאות דרך קנה הנשימה. לגמרי לנפח את הריאות עם דיו עד שאתה מרגיש התנגדות חזקה.
  5. השתמש מספריים כדי לחתוך את קנה הנשימה. Slide זוג מלקחיים תחת הריאות ולהרים אותם העכבר. שוטפים את הריאות בקצרה בכוס 1 ליטר של מים.
  6. במנדף כימי קטר, להעביר את הריאות בקבוקון זכוכית scintillation המכיל 5 מ"ל של הפתרון של Fekete. רקמת הגידול תצא כמו גושים לבנים על הריאות שחור אחרי כמה דקות. גידולים יכולים כעת לסמוך ומאוחסנים הפתרון של Fekete ללא הגבלת זמן.

4. נציג גרורות בריאות דמיינו

  1. הנה, הריאות מעכברים כי הוזרקו תאים החלב 4T1 קרצינומה קו להראות כתמים לבנים המעידים גידולים. עכברים הוזרקו תאים 4T1 transfected עם K79E דומיננטי שלילי IRF8 מוטציה להראות את הפוטנציאל גרורתי מוגברת של תאים סרטניים.
  2. תמונות אלו מראות ניתוח היסטולוגית של יעילות חיסוני CTL העברת המאמצת. גידול נושאות עכברים שהוזרק עם מלוחים הראו גידולים מרובים 6 ימים לאחר מכן, שמסומן על ידי חיצים צהובים (A). עכברים שהוזרק עם גידול ספציפי בתאי T, לעומת זאת, הראה ירידה של גידולים (B).
  3. בניסוי דומה, טיפול הודו דיו נותן דרך פשוטה למדוד את היעילות של העברת המאמצת CTL. כאן, גושים סרטניים לבן על נושאות גידולים הריאות הבחנה ברורה להם מהריאות שעברו בהצלחה העברת המאמצת CTL, וספירת גושים מאפשר לתוארשל quantitation לא אפשרי עם היסטולוגיה.

5. נציג תוצאות

איור 1
באיור 1. תכנית ניסיונית עבור גרורות הגידול ניסיוניים CTL חיסוני אדפטיבית העברת במודל עכבר. נקודות אדומות מצביעות תאים סרטניים נקודות ירוק עולה ההרג.

איור 2
איור 2. שיבוש של תפקוד משופר IRF8 פוטנציאל גרורתי של תאים סרטניים. עכבר החלב קרצינומה 4T1 הקו היה transfected ביציבות עם וקטור (4T1.Vector) או וקטור הבעת IRF8 דומיננטי שלילי מוטציה K79E (4T1.IRF8K79E) (15, 16). תאים סרטניים הוזרקו לתוך ורידים iv העכבר הזנב לרוחב. גידול נושאות הריאות היו מנופחים עם דיו הודו לדמיין גושים סרטניים. גושים גידול נתפסים בקלות כמו כתמים לבנים על רקע שחור רקמת הריאות.

איור 3
איור 3. ניתוח היסטולוגית של יעילות חיסוני CTL העברת המאמצת. סרקומה עכבר התא קו CMS4-Met שהוזרק לתוך הוורידים iv העכבר לרוחב הזנב. שלושה ימים לאחר מכן, מלוחים (א) או גידולים מסוימים בתאי T (B) הוזרקו נושאות גידולים בעכברים. ריאות נותחו שישה ימים לאחר הטיפול על ידי CTL מכתים H & E המקובלת היסטולוגית. גושים גידול מסומנים על ידי חצים.

איור 4
איור 4. ויזואליזציה של גושים הגידול באינפלציה דיו בהודו. סרקומה עכבר התא קו CMS4-Met שהוזרק לתוך הוורידים iv העכבר לרוחב הזנב. שלושה ימים לאחר מכן, מלוחים (Control) או גידולים מסוימים בתאי T (+ CTL) הוזרקו נושאות גידולים בעכברים. ריאות נותחו ארבעה עשר ימים לאחר הטיפול CTL. כתמים לבנים, אשר הם גושים סרטניים, לאפשר כימות קל של יעילות הטיפול CTL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

עכברים נרכשו מן המכון הלאומי לסרטן (Friderick, MD) ו שוכנו הספר לרפואה של מתקן חיה ג'ורג'יה. ניסויים וטיפול / הרווחה היו בהסכם עם תקנות פדרליות ואת פרוטוקול שאושר על ידי בית הספר לרפואה של ג'ורג'יה IACUC הוועדה.

Acknowledgments

נתמך על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (CA133085 כדי KL) לבין האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן (RSG-09-209-01-TBG כדי KL).

Materials

Solutions:

India Ink Solution (17):

  1. Pour 150 ml of distilled water into a 250 ml flask.
  2. Add 4 drops ammonium hydroxide to the distilled water.
  3. Add 30 ml India Ink stock (i.e. Sanford Black Magic Waterproof Drawing Ink 4465 Item 44011) to the ammonia and water mixture.
  4. Top off with distilled water to a volume of 200 ml. Solution is ready for injection.

Fekete's Solution (17):

Fekete's solution is used to bleach India ink-inflated tumor-bearing lungs to distinguish white tumor nodules from the black background of normal tissues.

  1. Add 350ml 95% EtOH to 1L glass bottle.
  2. Add 150ml distilled water
  3. Add 50ml formaldehyde
  4. Add 25ml glacial acidic acid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ryan, M. H., Bristol, J. A., McDuffie, E., Abrams, S. I. Regression of extensive pulmonary metastases in mice by adoptive transfer of antigen-specific CD8(+) CTL reactive against tumor cells expressing a naturally occurring rejection epitope. J Immunol. 167, (8), 4286-4292 (2001).
  2. Caldwell, S. A., Ryan, M. H., McDuffie, E., Abrams, S. I. The Fas/Fas ligand pathway is important for optimal tumor regression in a mouse model of CTL adoptive immunotherapy of experimental CMS4 lung metastases. J Immunol. 171, (5), 2402-2412 (2003).
  3. Liu, K., Caldwell, S. A., Greeneltch, K. M., Yang, D., Abrams, S. I. CTL Adoptive Immunotherapy Concurrently Mediates Tumor Regression and Tumor Escape. J Immunol. 176, (6), 3374-3382 (2006).
  4. Yang, D., Stewart, T. J., Smith, K. K., Georgi, D., Abrams, S. I., Liu, K. Downregulation of IFN-gammaR in association with loss of Fas function is linked to tumor progression. International journal of cancer. 122, (2), 350-362 (2008).
  5. Pages, F., Berger, A., Camus, M. Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer. N Engl J Med. 353, (25), 2654-2666 (2005).
  6. Galon, J., Costes, A., Sanchez-Cabo, F. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science. 313, (5795), 1960-194 (2006).
  7. Strater, J., Hinz, U., Hasel, C. Impaired CD95 expression predisposes for recurrence in curatively resected colon carcinoma: clinical evidence for immunoselection and CD95L mediated control of minimal residual disease. Gut. 54, (5), 661-665 (2005).
  8. Camus, M., Tosolini, M., Mlecnik, B. Coordination of intratumoral immune reaction and human colorectal cancer recurrence. Cancer research. 69, (6), 2685-2693 (2009).
  9. Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Yang, J. C. Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma. J Clin Oncol. 23, (10), 2346-2357 (2005).
  10. Srivastava, M. K., Sinha, P., Clements, V. K., Rodriguez, P., Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T-cell activation by depleting cystine and cysteine. Cancer research. 70, (1), 68-77 (2010).
  11. Nagaraj, S., Gabrilovich, D. I. Tumor escape mechanism governed by myeloid-derived suppressor cells. Cancer research. 68, (8), 2561-2563 (2008).
  12. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature reviews. 9, (4), 274-284 (2009).
  13. Heijstek, M. W., Kranenburg, O., Rinkes, B. orel, H, I. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Digestive surgery. 22, (1-2), 1-2 (2005).
  14. Yang, D., Ud Din, N., Browning, D. D., Abrams, S. I., Liu, K. Targeting lymphotoxin beta receptor with tumor-specific T lymphocytes for tumor regression. Clin Cancer Res. 13, (17), 5202-5210 (2007).
  15. Yang, D., Thangaraju, M., Browning, D. D. IFN Regulatory Factor 8 Mediates Apoptosis in Nonhemopoietic Tumor Cells via Regulation of Fas Expression. J Immunol. 179, (7), 4775-4782 (2007).
  16. Yang, D., Thangaraju, M., Greeneltch, K. Repression of IFN regulatory factor 8 by DNA methylation is a molecular determinant of apoptotic resistance and metastatic phenotype in metastatic tumor cells. Cancer research. 67, (7), 3301-3309 (2007).
  17. Wexler, H. Accurate identification of experimental pulmonary metastases. Journal of the National Cancer Institute. 36, (4), 641-645 (1966).
גרורה ניסויית חיסוני CTL המאמצת העברת דגם עכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model. J. Vis. Exp. (45), e2077, doi:10.3791/2077 (2010).More

Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model. J. Vis. Exp. (45), e2077, doi:10.3791/2077 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter