تحديد الجينات المستحثة بواسطة Dysregulated الفيروسة ساركومة المرتبطة كابوزي (KSHV)
Summary
العوامل الخلية المضيفة تلعب دورا حاسما في إنشاء وصيانة ساركومة كابوزي (كانساس). نحن مخطط طرق لتحديد العوامل الخلية المضيفة تغيير في الخلايا المصابة KSHV DMVEC ، وفي نسيج الورم KS وسوف تغير من الجينات الخلوية الفيروس بمثابة هدف محتمل ل المداواة الرواية.
Abstract
KS حاليا هو الأكثر الغالب فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز خبيثة ذات الصلة في افريقيا الجنوبية ، وبالتالي في العالم ، 1،2 ويتميز بأنه من الخلايا السرطانية angioproliferative بطانة الأوعية الدموية وتنتج الخلايا باء الأمراض النادرة يمفاوية في شكل اللمفومات الانصباب الجنبي (PEL) وبعض أشكال المرض في عديد المراكز Castleman. 3-5 1-5 ٪ فقط من الخلايا في KS الآفات تدعم بنشاط من تكرار lytic كابوزي ساركومة المرتبط هربس (KSHV) ، العامل المسبب للمرض المرتبطة KS ، ومن الواضح أن هناك عوامل يجب الخلوية تتفاعل مع عوامل فيروسية في عملية oncogenesis وتقدم الورم. 6،7 تحديد رواية المضيف عامل المحددات التي تساهم في أمراض KS أمر ضروري لوضع علامات لتطور الورم النذير والانبثاث فضلا عن تطوير علاجات جديدة لعلاج KS 8 تفاصيل الفيديو المصاحبة للأساليب التي نستخدمها لتحديد استضافة برامج التعبير الخلية الجينات في خلايا الجلد تغيير بطانة الاوعية الدموية الدقيقة (DMVEC) بعد الإصابة KSHV في نسيج الورم وKS 9 حالما يتم تحديدها من خلال تحليل الجينات dysregulated ميكروأري ، والتغيرات في تعبير البروتين أكدت طخة مناعية والمزدوجة المناعي المسمى. وأكد تغييرات في التعبير عن الجينات الترانسكربتي dysregulated في المختبر بواسطة الكمي في الوقت الحقيقي بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (qRT – PCR). كما يتم تنفيذ التحقق من النتائج في المختبر باستخدام المحفوظات نسيج الورم KS المزدوجة التي وصفت وكيمياء مناعية ميكروأرس الأنسجة. 8،10 نهجنا لتحديد الجينات dysregulated في نسيج الورم KS المكروية سيسمح للتنمية في المختبر وبعد ذلك في نموذج الجسم الحي للأنظمة اكتشاف وتقييم علاجية جديدة محتملة لعلاج KS.
Protocol
Discussion
لا يمكن أن يؤديها المنهجيات المستخدمة في هذا التقرير في مجموعة متنوعة من البيئات المختبر. أنها تتطلب بعض المعدات الخاصة أو الوصول إلى المرافق الأساسية. يجب اتخاذ الاحتياطات المناسبة عند القيام التجارب التي تنطوي على مسببات الأمراض الفيروسية المعدية مثل KSHV التي قد ت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جيمس EK Hildreth ، ميهاري كلية الطب ، لتقديم المشورة له ومراجعة هذه المخطوطة. ونحن نشكر أيضا ديانا Marver للتحرير للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل مركز فاندربيلت ميهاري لأبحاث الإيدز (NIH منح AI054999 P30 – 05) ، ومركز للصحة الإيدز التفاوتات البحوث والمعاهد الوطنية للصحة منح 5U54 RR019192 – 05 ، ومركز للبحوث السريرية ميهاري ، NIH P20RR011792 غرانت ، والمعاهد الوطنية للصحة منح CA113239 P01. وقد مولت جزئيا من منح دجا التجريبية من مركز فاندربيلت ، ميهاري لأبحاث الإيدز (CFAR) ومركز للبحوث السريرية ميهاري (CRC).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | ||
| TPA | Sigma | P1585 | ||
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | ||
| Sodium butyrate | Sigma | 19364 (FLUKA) | ||
| EBM-2 media | Lonza | CC-3156 | + bullet kits supplement | |
| DMVEC cells (HMVEC) | Lonza | CC2543 | ||
| Fetal calf serum | Hyclone | SH30066.03 | ||
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Chamber slides | Nalgene | 154461 | ||
| KSHV LANA Mab | Vector Labs | VP-H913 | 1:50 dilution/IFA | |
| Galectin-3 goat pAb | R&D Systems | AF1154 | ||
| Donkey-anti-goat FITC | Jackson ImmunoRessearch | 705-095-1 | ||
| Donkey-anti-goat Rho | Jackson ImmunoRessearch | 705-295-003 | 1:100 dilution/IFA | |
| Mounting media | Vector Labs | H 1500 | Vectashield with DAPI | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23235 | ||
| Nitrocellulose | Bio-Rad | 161-0112 | ||
| Donkey-anti-goat-conj. | Santa Cruz | SC 2020 | ||
| Western substrate | Pierce | 34075 | ||
| Biotin-rabbit-anti goat | DAKO | 305-065-045 | ||
| AP-Strepavidin conj. | DAKO | K 0492 (kit) | ||
| RNase DNase Free Set | Qiagen | 79254 | ||
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | ||
| Bio-Photometer | Eppendorf | 952000006 | ||
| RC 6 Plus Centrifuge | Sorvall | 46910 | ||
| Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman | 392052 | ||
| MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System | Bio-Rad | 170-9770 | ||
| TE 2000S Fluorescent microscope | NIKON | TE2000S | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938C | ||
| Eclipse E 200 | NIKON | E 200 | ||
| Sorvall Legend RT Centrifuge | Thermo | 75004377 |
References
- Sitas, F., Newton, R. Kaposi’s sarcoma in South Africa. J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).
- Moore, P. S., Chang, Y., Knipe, D. M., Howley, P. M. Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus. Field’s Virology. , 2803-2833 (2002).
- Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).
- Cesarman, E., Knowles, D. M. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi’s sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman’s disease. Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).
- Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. J Virol. 76, 3421-3439 (2002).
- Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells. J Virol. 71, 715-719 (1997).
- Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi’s sarcoma. Glycobiology. , (2009).
- Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. Spindle cell conversion by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures. J Virol. 75, 5614-5626 (2001).
- Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma. Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).
