Summary
このプロトコルでは、我々は、ある軸索の成長にグリア細胞の不均一性の影響を研究する新しい方法を説明
Abstract
すべての哺乳類の中枢神経系では、損傷後の切断軸索が元のターゲットに再生成することができないと機能回復は1非常に悪いです。軸索再生の失敗は、敵対的なグリア細胞の環境を含むいくつかの要因の組み合わせの結果である、抑制性ミエリン関連分子と内因性ニューロン再生の容量2を減少させた。アストロサイトは、中枢神経系で最も優勢なグリア細胞の種類であり、生理学及び病理学の条件3の下軸索の機能に重要な役割を果たす。相同なオリゴデンドロサイトとは対照的に、アストロサイトは、多様な形態と遺伝子発現4別の星状膠細胞亜集団によって構成される不均一な細胞集団である。このような軸索の成長に与える影響として、この不均一性の機能的意義は、、あまり知られていない。
特にグリア細胞、神経細胞の挙動におけるアストロサイト異質の機能を調べるために、我々は、ラットの大脳皮質から得られるグリア細胞と共培養する高精製された後根神経節の神経細胞によって新しい方法を確立した。この技術によって、我々が直接、同一条件で別の星状膠細胞の亜集団のニューロンの接着と軸索の成長を比較することができた。
このレポートでは、我々はこのアストロサイトの単離および培養のための方法、後根神経節ニューロンの単離及び精製、及びアストロサイトとニューロンのDRGの共培養の詳細なプロトコルを与える。この方法はまた、ニューロンとグリア細胞間の細胞または地域の特定の相互作用を研究するために他の脳領域に拡張することができます。
Protocol
1。グリア細胞培養
グリア細胞は中枢神経系のさまざまな地域から培養することができる。全体のプロセスは、プロセスの図に示します。
1日目コーティング培養プレートとカバースリップ
- オートクレーブで滅菌したガラスの顕微鏡の円形のカバースリップを乾かします。
- 滅菌24ウエル培養プレートにプレート滅菌カバースリップ。
- コートポリ-リジンと根温下で2時間インキュベートするとカバースリップ。
- ステップ3と同じ方法でコート6ウェル培養プレート。
- カバーガラスと蒸留水と文化のフードの乾燥空気と二度6ウェル培養プレートを洗浄してください。
- 24ウェルプレートに各ウェルに200μLのDMEM培地（10％FBS）を追加し、6ウェルプレートの各ウェルに2mLのと、5％CO 2で37度の下インキュベーターに入れてください
皮質とグリア細胞培養を分離する2日目
- 正流の解剖のフードを滅菌する。
- 20分間UVライトをオンにします。
- 70％エタノールですべての面をスプレーし、使用前に15分待つ。
- 緊張変更：麻酔ラットの低体温による仔（P2〜P6）、およびオペレーティングはさみを使用してframenマグナムのベースで首を切る。
- 頭蓋骨オフアイリスのはさみと皮を使用して矢状縫合に沿って頭蓋を開きます。
- 前脳を除去し、チルドL15培地中にそれらを置くには、実体顕微鏡下で、慎重に、血管を硬膜と軟膜膜をきれいに皮質を分離し、L15培地で数回洗浄する。
- マイクロサージェリーのはさみと小さな断片に皮質を切り取ります。
- 皮質の部分と15分間37℃でインキュベートにL15培地を用いて調製したトリプシン- EDTA 0.125パーセントを追加。
- 火ポリッシュガラスPasteureピペットで20回上下に組織液を吸引し、最終濃度の10ug/mLへのDNaseストック溶液を追加し、50mLのチューブに20％FBSと20mlのDMEM培地に組織ブロックを転送する、単一の細胞懸濁液を収集する。
- 10％FBSを含むDMEM中で、DMEM培地で細胞懸濁液を再サスペンド細胞を一度に洗う、5000-10000/cm 2で、血球計数器を顕微鏡下で種子の細胞を細胞を数える。 37度5パーセントインキュベーター内で細胞を維持するため、週に培地2回の半分を変更する。
2。後根神経節ニューロンの単離、培養および精製
1日目は、文化の材料を準備します。
- コートポリ-リジン、洗浄カバーグラスを持つ滅菌カバーグラスが水と空気の乾燥を蒸留で2回、24ウェルプレートに入れてください。
- 2パーセントB27と2.5S NGF（50 ng / mL）を持つ100μLNeurobasal培地を追加し、37度5％CO 2にプレートを置く。
2日目は、胚からDRGSを分離
- グリア細胞培養と同じように流フードを滅菌。
- CO 2、70％エタノールで滅菌腹部に過剰投与による妊娠ラット（E15）を安楽死、胚を子宮から単離し、チルドL15培地に入れた。
- 実体顕微鏡とチルドL15培地で35ミリメートル料理への転送で接続後根神経節と脊髄を分離する。
- 単一の細胞懸濁液を収集し、NBFの培地（2％B27と2.5S NGF（50 ng / mLの）を含むNeurobasal培地）で1回洗浄する。
3日目は、DRGニューロンを精製
- ニューロンの播種後18時間〜24時間、20μMの最終濃度と、200μLの最終容量にニューロンの培養液に1 mMの濃FUDRのストック溶液を加える。
- 72時間後から、FUDRなしで2パーセントB27と2.5S NGF（50ng/mL）を含むNeurobasal培地で半分培地を交換してください。その後、一日おきに培地を変更してください。
3。グリア細胞との共培養DRGニューロン
- グリア細胞培養がコンフルエンス（播種後20日前後）に達したとき、彼らはニューロンとの共培養のための準備ができていました。
- 24時間精製されたニューロンを追加する前に、グリア細胞の培地を2％B27と2.5S NGF（50 ng / mL）を含むNeurobasal培地に変更されました。
- 精製された神経細胞が培養ウェルから収集された、単一細胞の懸濁液は、火災研磨Pasteureのピペットを介して機械的に渡すことで得られた。
- 数をカウントした後に、ニューロンを2％B27と2.5S NGF（50ng/mL）を含むNeurobasal培地でコンフルエントグリア細胞に500/cm 2で播種した。
- グリア細胞の神経細胞の接着や神経突起の成長を記録し、細胞型特異的抗体を用いて画像解析ソフトウェアと免疫細胞化学によって異なる時点で分析することができます。
4。代表的な結果
- グリア細胞の培養：接種した後、グリア細胞は20日周りにコンフルエントになる。位相コントラストmicrosc下OPE、それは簡単に別の形態学的なグリア細胞の亜集団は異なった成長パターンの部分構造を形成し、immuocytochemisty手法（図1、図2）で示されるようにGFAP正のアストロサイトは90％以上を占めることが確認された。
- DRGニューロン文化：私たちの方法では、72時間FUDRの治療後、DRGニューロンの純度は6日以内に99％にも達するだろう、DRGニューロンは、そのユニークな形態を示し、高密度の神経突起の成長（図3、図4）で。
- グリア細胞と神経細胞の共培養：DRGニューロンの接着や神経突起伸長は播種後4時間以内にグリア細胞に容易に発生し、注意深い観察がニューロンの接着や神経突起の成長は特殊な成長パターンの部分構造を形成するグリア細胞の亜集団の影響を受けていたことを示した、これは容易に同定することができた位相差顕微鏡下および免疫細胞化学（図5、図6）から。
図1。コンフルエントグリア細胞の形態。皮質のグリア細胞はポリリジンコートしたカバースリップ上に播種し、20日間培養した、グリア細胞、放射方向に配置された左側のセルの異なる成長パターンに注意してください。
図2。グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）抗体で標識したコンフルエントグリア細胞は。右側のGFAP（赤）陽性細胞の放射配置に注意してください。
図3。後根神経節ニューロンはFUDRの治療せずにin vitroで成長した。混入細胞はDRGニューロン"の背景を形成する。
図4。後根神経節ニューロンはFUDRの治療後にin vitroで成長した。背景混入細胞が完全に除去されていた。
図5。グリア細胞上に成長した後根神経節ニューロン。神経細胞の接着や神経突起の成長は、放射配置細胞に阻害し、右側のグリア細胞に限られていた。
図6。ニューロフィラメント抗体で標識されたグリア細胞に成長する後根神経節ニューロン。神経突起（緑色）が抑制された左側のグリア細胞を配置し、右側に限ら照射で、すべてのグリア細胞はGFAP抗体（赤）で標識した。
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Discussion
この実験のプロトコルは、グリア細胞、神経細胞の接着や神経突起の成長に特にアストロサイトの不均質性の影響を検討する2つの目標を達成するために設計されました。最初の目標は、この実験ではアストロサイトの不均一性を可能な限り、維持することでした、コンフルエントグリア細胞培養濃縮星状膠細胞は、さらに細胞を損傷し、アストロサイトの傷害応答を誘発する可能性のある化学的処理と消化の伝播、なしで初代培養を混合した。最後の星状膠細胞純度はfibrobasts FNによって検証として1％未満汚染の線維芽細胞で、90％以上GFAP陽性である。始まる作られた細胞における低播種密度は、合流前に分裂のいくつかのラウンドを受ける。位相差顕微鏡下では、グリア細胞の不均一性は、異なる形態的星状膠細胞によって形成された別の部分構造が観察された。第二の目標は、高精製されたDRGニューロンを取得することでしたし、ニューロンの動作上の不均質性の影響を検討するグリア細胞でそれらを共培養。このような線維芽細胞やシュワン細胞などの後根神経節における混入細胞は明らかにこの不要な影響を避けるために、培養条件5,6の軸索の成長に影響を及ぼすか変えることができる、DRGニューロンは、無血清培地で培養し、すべてを殺すために72時間のためにFUDRで処理した他の細胞型。この処理の後、DRGニューロンは99％と高い精製することができます。それは、神経細胞の培養を数回7を治療するために必要がある従来の方法よりも効率的であった。単一のDRGニューロンの接着と軸索の成長を容易に監視し、時間経過の記録と画像解析法による位相差顕微鏡下で追跡することが、グリア細胞の相互作用は、免疫細胞化学および電子顕微鏡法により詳細に分析することができます。
それは、DRGニューロンが4週間以上in vitroで維持できないと指摘された、彼らの生存率は低下の兆候はなかったが、彼 らはもはや基質に付着することができなかった、通常、彼らはデタッチとロールアップするでしょう。
DRGニューロンは、長い間、アストログリア細胞（2ヶ月以上）で維持することができます。高精製されたDRGニューロンとアストロサイトとの間のこの長期共培養がより容易にアストロサイトの別のタイプの単一のニューロンと軸索の成長の追跡を行う、それはまた後根神経節内の他の汚染細胞から制御不能の影響を避ける。全培養プロセス中に、すべてのセルが慎重に扱われるべきとすべての細胞は常に培養液中に浸漬する必要があります。高純度のDRGニューロンを取得するには、臨界点がFUDRの治療の期間である、以上の72時間の治療は大幅にすべての汚染細胞を死滅されない場合があります細胞生存性と短い時間で治療が漏洩する危険性があります。最適な状態では、我々は1週間以内に高純度のDRGニューロンを大量に入手することができます。この共培養系を用いて、我々は一般的な信念とは対照的に、異種のアストロサイトは神経細胞の接着や軸索の成長にさまざまな影響を持っていた、ことがわかった、と亜集団のアストロサイトはニューロンの接着と軸索の成長の両方に強い阻害を示した。アストロサイトと軸索の成長との間の相互作用に加えて、この方法は、ミエリン形成、神経発達の本質的な軸索の成長能力の変化、遺伝子と軸索の成長に関わるシグナル伝達経路として他の研究に基づいて使用することができる。また、神経細胞とグリア細胞間の相互作用を研究するためにマウスや他の動物の中枢神経系領域で使用することができます。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この研究はFMMU新しい発見の基盤と部分的にNIHの資金提供によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM(high glucose) | Invitrogen | 10313-039 | |
| L15 medium | Invitrogen | 11415-114 | |
| FBS | Invitrogen | 10437-077 | |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| poly-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | culture grade |
| NGF(2.5S) | Invitrogen | 13257-019 | |
| B27 supplyment | Invitrogen | 17504-044 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| neurofilament antibody | Abcam | ab24575 |
References
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