इस प्रोटोकॉल में हम एक घुलनशील प्रोटीन डिटर्जेंट जटिल के रूप में अभिव्यक्ति, solubilization, और एक recombinantly व्यक्त झिल्ली प्रोटीन, MexB की शुद्धि, का प्रदर्शन. MexB अवसरवादी बैक्टीरियल रोगज़नक़ Pseudomonas aeruginosa से बहुऔषध प्रतिरोध झिल्ली ट्रांसपोर्टर है.
बहुऔषध प्रतिरोध (एमडीआर), एक कैंसर कोशिका या रोगज़नक़ की क्षमता के लिए संरचनात्मक और कार्यात्मक रूप से असंबंधित विरोधी कैंसर दवाओं या एंटीबायोटिक दवाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए प्रतिरोधी हो, सार्वजनिक स्वास्थ्य में वर्तमान गंभीर समस्या है. इस बहुऔषध प्रतिरोध काफी हद तक ऊर्जा निर्भर दवा तपका पंप के कारण है. पंप बाहरी माध्यम में कैंसर रोधी दवाओं या एंटीबायोटिक दवाओं को निष्कासित, उनके एक जहरीले सीमा से नीचे intracellular एकाग्रता कम. हम Pseudomonas aeruginosa, एक अवसरवादी जीवाणु रोगज़नक़ है कि चोट या बीमारी के कई प्रकार के के साथ रोगियों में संक्रमण का कारण बनता है में बहुऔषध प्रतिरोध का अध्ययन कर रहे हैं, उदाहरण के लिए, जलता है या सिस्टिक फाइब्रोसिस, और भी इम्युनो – समझौता कैंसर, डायलिसिस, और प्रत्यारोपण के रोगियों में. पी. में प्रमुख एमडीआर तपका पंप aeruginosa त्रिपक्षीय परिसरों एक आंतरिक झिल्ली प्रोटॉन दवा (RND) antiporter, एक बाहरी झिल्ली चैनल (OMF), और एक periplasmic linker (MFP) प्रोटीन 1-8 शामिल हैं. RND और OMF प्रोटीन transmembrane प्रोटीन होते हैं. Transmembrane प्रोटीन सभी प्रोटीन का 30% से अधिक बनाने के लिए और मौजूदा दवा लक्ष्य का 65% हैं. हाइड्रोफोबिक transmembrane डोमेन प्रोटीन जलीय बफर में अघुलनशील बनाते हैं. इससे पहले एक transmembrane प्रोटीन शुद्ध किया जा सकता है है, यह आवश्यक है के लिए बफर शर्तों युक्त एक हल्के साबुन है कि प्रोटीन एक प्रोटीन डिटर्जेंट परिसर (PDC) 9-11 के रूप में solubilized सक्षम मिल. इस उदाहरण में, हम एक RND प्रोटीन, पी. का उपयोग aeruginosa MexB transmembrane ट्रांसपोर्टर, प्रदर्शित करने के लिए कैसे एक transmembrane प्रोटीन का एक फार्म रीकॉम्बीनैंट व्यक्त करने के लिए, यह डिटर्जेंट का उपयोग solubilize, और फिर शुद्ध प्रोटीन डिटर्जेंट परिसरों. यह सामान्य विधि अभिव्यक्ति, शुद्धि, और कई अन्य recombinantly व्यक्त झिल्ली प्रोटीन के solubilization लागू किया जा सकता है. प्रोटीन डिटर्जेंट परिसरों बाद में जैव रासायनिक या biophysical एक्स – रे क्रिस्टल संरचना निर्धारण या crosslinking अध्ययन सहित लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
प्रतिरोध, आयन परिवहन, संचार सेल सेल, पुटिका परिवहन, सेलुलर संरचना के रखरखाव, और मेजबान रोगज़नक़ बातचीत सहित कई महत्वपूर्ण सेलुलर गतिविधियों, बहुऔषध के अलावा, प्रोटीन है कि कोशिका झिल्ली में एम्बेडेड र?…
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन और Biomolecular विज्ञान के लिए सोसायटी से CJJ अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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SDS sample buffer | Biorad | 161-0737 | ||
C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | ||
kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | ||
2XYT media | Fisher | BP2466-2 | ||
LB media | Fisher | AC61189-5000 | ||
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | ||
DNaseI | Fisher | BP3226-1 | ||
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | ||
Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche | 11 873 580 001 | ||
NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | ||
NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | ||
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | ||
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | ||
Glycerol | Fisher | BP229-1 | ||
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | ||
15ml tubes | Corning | 430052 | ||
See-Saw Rocker | Fisher | SSL 4 | ||
Talon metal affinity resin | Clontech | 635503 | ||
imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | ||
10% polyacrylamide SDS PAGE gels | BioRad | 161-1454 | ||
Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | BioRad | 161-0732 | ||
Kaleidascope prestained molecular weight markers | BioRad | 161-0324 | ||
Superose 12 30/10 column | GEHealthcareSuperose | 12 10/300 GL | ||
Amicon centrifugal concentrator | Millipore | UFC801024 | ||
Syringe filter | Fisher | SLFG R04 NL | ||
Fernbach flasks | Fisher | 09-552-39 | ||
Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | |||
Akta system | GE Healthcare | |||
J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman | |||
1 l centrifuge bottles | Beckman | 969329 | ||
RC-5 centrifuge | ThermoScientific | |||
SS34 fixed-angle rotor and tubes | ThermoScientific | |||
Sorvall floor model Ultracentrifuge | ThermoScientific | |||
T647.5 rotor and tubes with caps | ThermoScientific | 08322 | ||
French Pressure Cell | ThermoScientific | FA-032 |