In questo protocollo dimostriamo l'espressione, solubilizzazione e la purificazione di una proteina di membrana ricombinanti espresse, MexB, come un complesso proteina solubile detergente. MexB è un trasportatore di membrana multifarmaco resistenza da parte degli agenti patogeni opportunistici batterici Pseudomonas aeruginosa.
Multiresistenza ai farmaci (MDR), la capacità di una cellula tumorale o patogeno per resistere ad una vasta gamma di strutturalmente e funzionalmente correlati farmaci anti-cancro o antibiotici, è un grave problema attuale della salute pubblica. Questa resistenza ai farmaci è in gran parte a causa di pompe per la somministrazione di energia-dipendente efflusso. Le pompe espellere farmaci anti-cancro o antibiotici nel mezzo esterno, riducendo la loro concentrazione intracellulare di sotto di una soglia di tossicità. Stiamo studiando la resistenza ai farmaci in Pseudomonas aeruginosa, un patogeno opportunistico che provoca infezioni batteriche nei pazienti con molti tipi di lesioni o malattie, per esempio, ustioni o fibrosi cistica, e anche in immuno-cancro, dialisi, trapianto e pazienti. Le principali pompe di efflusso MDR in P. aeruginosa sono complessi tripartita composta da una membrana interna protone-droga antiporter (RND), un canale di membrana esterna (OMF), e una proteina linker periplasmatico (MFP) 1-8. Le proteine RND e OMF sono proteine transmembrana. Proteine transmembrana rappresentano oltre il 30% di tutte le proteine e il 65% dei bersagli farmacologici in corso. I domini transmembrana idrofobici produrre le proteine solubili in tampone acquoso. Prima di una proteina transmembrana può essere purificato, è necessario trovare le condizioni tampone contenente un detergente delicato che consentono la proteina di essere solubilizzati come un complesso detergente proteico (PDC) 9-11. In questo esempio, usiamo un RND proteine, il P. aeruginosa transmembrana trasportatore MexB, per dimostrare come esprimere una forma ricombinante di una proteina transmembrana, solubilizzare usando detersivi, e poi purificare i complessi proteici detergente. Questo metodo generale può essere applicato l'espressione, la purificazione, e la solubilizzazione di molte altre proteine di membrana ricombinanti espresse. I complessi proteici detergente può essere utilizzato successivamente per la caratterizzazione biochimica e biofisica tra cui X-ray determinazione della struttura cristallina o studi di reticolazione.
Oltre alla resistenza multidrug, molte attività vitali cellulari, compreso il trasporto di ioni, comunicazione cellula-cellula, il trasporto delle vescicole, il mantenimento della struttura cellulare, e interazioni ospite-patogeno, coinvolgono le proteine che sono incorporati nella membrana cellulare. Proteine transmembrana costituiscono oltre il 30% di proteine note e sono gli obiettivi per la maggior parte dei farmaci oggi in uso. Il pieghevole improprio o attività delle proteine transmembran…
The authors have nothing to disclose.
Questo progetto è stato sostenuto dalle concessioni per CJJ dalla National Science Foundation e la Società per Scienze Biomolecolari.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
SDS sample buffer | Biorad | 161-0737 | ||
C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | ||
kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | ||
2XYT media | Fisher | BP2466-2 | ||
LB media | Fisher | AC61189-5000 | ||
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | ||
DNaseI | Fisher | BP3226-1 | ||
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | ||
Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche | 11 873 580 001 | ||
NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | ||
NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | ||
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | ||
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | ||
Glycerol | Fisher | BP229-1 | ||
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | ||
15ml tubes | Corning | 430052 | ||
See-Saw Rocker | Fisher | SSL 4 | ||
Talon metal affinity resin | Clontech | 635503 | ||
imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | ||
10% polyacrylamide SDS PAGE gels | BioRad | 161-1454 | ||
Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | BioRad | 161-0732 | ||
Kaleidascope prestained molecular weight markers | BioRad | 161-0324 | ||
Superose 12 30/10 column | GEHealthcareSuperose | 12 10/300 GL | ||
Amicon centrifugal concentrator | Millipore | UFC801024 | ||
Syringe filter | Fisher | SLFG R04 NL | ||
Fernbach flasks | Fisher | 09-552-39 | ||
Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | |||
Akta system | GE Healthcare | |||
J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman | |||
1 l centrifuge bottles | Beckman | 969329 | ||
RC-5 centrifuge | ThermoScientific | |||
SS34 fixed-angle rotor and tubes | ThermoScientific | |||
Sorvall floor model Ultracentrifuge | ThermoScientific | |||
T647.5 rotor and tubes with caps | ThermoScientific | 08322 | ||
French Pressure Cell | ThermoScientific | FA-032 |