Summary

Espressione, solubilizzazione detergente, e purificazione di un trasportatore di membrana, la proteina multiresistente MexB Resistenza

Published: December 03, 2010
doi:

Summary

In questo protocollo dimostriamo l'espressione, solubilizzazione e la purificazione di una proteina di membrana ricombinanti espresse, MexB, come un complesso proteina solubile detergente. MexB è un trasportatore di membrana multifarmaco resistenza da parte degli agenti patogeni opportunistici batterici Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

Multiresistenza ai farmaci (MDR), la capacità di una cellula tumorale o patogeno per resistere ad una vasta gamma di strutturalmente e funzionalmente correlati farmaci anti-cancro o antibiotici, è un grave problema attuale della salute pubblica. Questa resistenza ai farmaci è in gran parte a causa di pompe per la somministrazione di energia-dipendente efflusso. Le pompe espellere farmaci anti-cancro o antibiotici nel mezzo esterno, riducendo la loro concentrazione intracellulare di sotto di una soglia di tossicità. Stiamo studiando la resistenza ai farmaci in Pseudomonas aeruginosa, un patogeno opportunistico che provoca infezioni batteriche nei pazienti con molti tipi di lesioni o malattie, per esempio, ustioni o fibrosi cistica, e anche in immuno-cancro, dialisi, trapianto e pazienti. Le principali pompe di efflusso MDR in P. aeruginosa sono complessi tripartita composta da una membrana interna protone-droga antiporter (RND), un canale di membrana esterna (OMF), e una proteina linker periplasmatico (MFP) 1-8. Le proteine ​​RND e OMF sono proteine ​​transmembrana. Proteine ​​transmembrana rappresentano oltre il 30% di tutte le proteine ​​e il 65% dei bersagli farmacologici in corso. I domini transmembrana idrofobici produrre le proteine ​​solubili in tampone acquoso. Prima di una proteina transmembrana può essere purificato, è necessario trovare le condizioni tampone contenente un detergente delicato che consentono la proteina di essere solubilizzati come un complesso detergente proteico (PDC) 9-11. In questo esempio, usiamo un RND proteine, il P. aeruginosa transmembrana trasportatore MexB, per dimostrare come esprimere una forma ricombinante di una proteina transmembrana, solubilizzare usando detersivi, e poi purificare i complessi proteici detergente. Questo metodo generale può essere applicato l'espressione, la purificazione, e la solubilizzazione di molte altre proteine ​​di membrana ricombinanti espresse. I complessi proteici detergente può essere utilizzato successivamente per la caratterizzazione biochimica e biofisica tra cui X-ray determinazione della struttura cristallina o studi di reticolazione.

Protocol

1. 1 ° giorno: MexB da Pseudomonas aeruginosa è codificato da pFB101. Il gene è stato amplificato da MexB P. aeruginosa DNA genomico e inserite nel NdeI e siti di restrizione XhoI del + pET30b vettore. Il costrutto contiene un C-terminale tag hexahistidine. Il plasmide viene utilizzato per trasformare E. coli ceppo C43 (DE3) 12, e il trasformanti sono placcati su agar LB contenente 30 ug / ml kanamicina. 2. …

Discussion

Oltre alla resistenza multidrug, molte attività vitali cellulari, compreso il trasporto di ioni, comunicazione cellula-cellula, il trasporto delle vescicole, il mantenimento della struttura cellulare, e interazioni ospite-patogeno, coinvolgono le proteine ​​che sono incorporati nella membrana cellulare. Proteine ​​transmembrana costituiscono oltre il 30% di proteine ​​note e sono gli obiettivi per la maggior parte dei farmaci oggi in uso. Il pieghevole improprio o attività delle proteine ​​transmembran…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo progetto è stato sostenuto dalle concessioni per CJJ dalla National Science Foundation e la Società per Scienze Biomolecolari.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
SDS sample buffer   Biorad 161-0737  
C43(DE3) E. coli strain   Lucigen 60345-1  
kanamycin sulfate   Sigma-Aldrich K4378  
2XYT media   Fisher BP2466-2  
LB media   Fisher AC61189-5000  
IPTG   Sigma-Aldrich I6758  
DNaseI   Fisher BP3226-1  
Lysozyme   Sigma-Aldrich L7651  
Complete EDTA-free protease inhibitor tablets   Roche 11 873 580 001  
NaP monobasic   Sigma-Aldrich S6566  
NaP dibasic   Sigma-Aldrich S5136  
NaCl   Sigma-Aldrich S6191  
MgCl2   Sigma-Aldrich M1028  
Glycerol   Fisher BP229-1  
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside   Anatrace D310  
15ml tubes   Corning 430052  
See-Saw Rocker   Fisher SSL 4  
Talon metal affinity resin   Clontech 635503  
imidazole   Sigma-Aldrich I5513  
10% polyacrylamide SDS PAGE gels   BioRad 161-1454  
Tris/glycine/SDS PAGE running buffer   BioRad 161-0732  
Kaleidascope prestained molecular weight markers   BioRad 161-0324  
Superose 12 30/10 column   GEHealthcareSuperose 12 10/300 GL  
Amicon centrifugal concentrator   Millipore UFC801024  
Syringe filter   Fisher SLFG R04 NL  
Fernbach flasks   Fisher 09-552-39  
Shaker to hold Fernbach flasks   Fisher Scientific    
Akta system   GE Healthcare    
J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor   Beckman    
1 l centrifuge bottles   Beckman 969329  
RC-5 centrifuge   ThermoScientific    
SS34 fixed-angle rotor and tubes   ThermoScientific    
Sorvall floor model Ultracentrifuge   ThermoScientific    
T647.5 rotor and tubes with caps   ThermoScientific 08322  
French Pressure Cell   ThermoScientific FA-032  

References

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Cite This Article
Bhatt, F. H., Jeffery, C. J. Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein. J. Vis. Exp. (46), e2134, doi:10.3791/2134 (2010).

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