Summary

Expression, tvättmedel Lösningsgörande, och rening av ett membran transportören, MexB multidrogresistensgenen Protein

Published: December 03, 2010
doi:

Summary

I detta protokoll visar vi uttrycket lösningsgörande, och rening av recombinantly uttryckt membranprotein, MexB som ett lösligt protein rengöringsmedel komplex. MexB är en multidrogresistensgenen membran transportör från de opportunistiska bakteriell patogen Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

Multidrogresistensgenen (MDR), möjligheten för en cancercell eller patogen att vara resistent mot ett brett spektrum av strukturellt och funktionellt oberoende cytostatika eller antibiotika, är ett aktuellt allvarligt problem i folkhälsan. Detta multidrogresistensgenen beror till stor del energiberoende pumpar efflux. Pumparna utvisa cytostatika eller antibiotika i externt medium, sänka sina intracellulära koncentrationen under en giftig tröskel. Vi studerar multidrogresistensgenen i Pseudomonas aeruginosa, en opportunistisk bakteriell patogen som orsakar infektioner hos patienter med många typer av skador eller sjukdom, till exempel brännskador eller cystisk fibros, och även i Immuno äventyras-cancer, dialys, och patienter transplantation. De stora MDR effluxpumpar i P. aeruginosa är tre parter komplex består av ett inre membran proton-läkemedel antiporter (RND), ett yttre membran kanal (OMF), och en periplasmic länkare protein (MFP) 1-8. Den RND och OMF proteiner transmembrane proteiner. Transmembrana proteiner utgör mer än 30% av alla proteiner och 65% av nuvarande målproteiner. Den hydrofoba transmembrana domäner gör de proteiner olösliga i vattenlösning buffert. Innan en transmembranös proteinet kan renas är det nödvändigt att hitta buffert villkor som innehåller ett milt diskmedel som gör att proteinet ska solubilized som ett protein rengöringsmedel komplex (PDC) 9-11. I detta exempel använder vi en RND protein, P. aeruginosa MexB transmembrana transportör, för att visa hur man uttrycker en rekombinant form av en transmembranös protein, löses den med diskmedel och sedan rena proteinkomplex rengöringsmedel. Denna allmänna metod kan tillämpas på uttrycket, rening och lösningsgörande många andra recombinantly uttryckt membranproteiner. Proteinet tvättmedel komplex kan senare användas för biokemiska och biofysiska karakterisering inklusive röntgen kristallstruktur beslutsamhet eller studier crosslinking.

Protocol

1. Dag 1: MexB från Pseudomonas aeruginosa kodas av pFB101. Den MexB gen förstärktes från P. aeruginosa genomiska DNA och sätts in i NdeI och XhoI platser begränsning av pET30b + vektor. Det konstruera innehåller en C-terminal hexahistidine tag. Den plasmiden används för att omvandla E. coli stam C43 (DE3) 12, och transformants är pläterade på LB-agar innehåller 30 ug / ml kanamycin. 2. Dag 2: Öve…

Discussion

Förutom multidrogresistensgenen, många viktiga cellulära aktiviteter, inklusive jontransport, cell-cell kommunikation, vesikler transporter, underhåll av cellstruktur, och värd-patogen interaktioner, innebär proteiner som är inbäddade i cellmembranet. Transmembrana proteiner utgör över 30% av de kända proteiner och är målen för de flesta läkemedel som används idag. Felaktig fällbara eller aktivitet av transmembrana proteiner leda till viktiga genetiska sjukdomar, inklusive cystisk fibros och diabetes. T…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Projektet har finansierats med bidrag till CJJ från National Science Foundation och Sällskapet för biomolekylär Sciences.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
SDS sample buffer   Biorad 161-0737  
C43(DE3) E. coli strain   Lucigen 60345-1  
kanamycin sulfate   Sigma-Aldrich K4378  
2XYT media   Fisher BP2466-2  
LB media   Fisher AC61189-5000  
IPTG   Sigma-Aldrich I6758  
DNaseI   Fisher BP3226-1  
Lysozyme   Sigma-Aldrich L7651  
Complete EDTA-free protease inhibitor tablets   Roche 11 873 580 001  
NaP monobasic   Sigma-Aldrich S6566  
NaP dibasic   Sigma-Aldrich S5136  
NaCl   Sigma-Aldrich S6191  
MgCl2   Sigma-Aldrich M1028  
Glycerol   Fisher BP229-1  
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside   Anatrace D310  
15ml tubes   Corning 430052  
See-Saw Rocker   Fisher SSL 4  
Talon metal affinity resin   Clontech 635503  
imidazole   Sigma-Aldrich I5513  
10% polyacrylamide SDS PAGE gels   BioRad 161-1454  
Tris/glycine/SDS PAGE running buffer   BioRad 161-0732  
Kaleidascope prestained molecular weight markers   BioRad 161-0324  
Superose 12 30/10 column   GEHealthcareSuperose 12 10/300 GL  
Amicon centrifugal concentrator   Millipore UFC801024  
Syringe filter   Fisher SLFG R04 NL  
Fernbach flasks   Fisher 09-552-39  
Shaker to hold Fernbach flasks   Fisher Scientific    
Akta system   GE Healthcare    
J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor   Beckman    
1 l centrifuge bottles   Beckman 969329  
RC-5 centrifuge   ThermoScientific    
SS34 fixed-angle rotor and tubes   ThermoScientific    
Sorvall floor model Ultracentrifuge   ThermoScientific    
T647.5 rotor and tubes with caps   ThermoScientific 08322  
French Pressure Cell   ThermoScientific FA-032  

References

  1. Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space. J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).
  2. Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).
  3. Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).
  4. Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).
  5. Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).
  6. Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).
  7. Tikhonova, E. B., Zgurskaya, H. I. AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli Form a Stable Intermembrane Multidrug Efflux. Complex. J. Biol. Chem. 279, 32116-3224 (2004).
  8. Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).
  9. Berger, B. W., Gendron, C. M., Robinson, C. R., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. The role of protein and surfactant interactions in membrane-protein crystallization. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 724-730 (2005).
  10. Jones, M. Surfactants in membrane solubilisation. Int. J. Pharm. 177, 137-159 (1999).
  11. Maire, M. l. e., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).
  12. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).

Play Video

Cite This Article
Bhatt, F. H., Jeffery, C. J. Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein. J. Vis. Exp. (46), e2134, doi:10.3791/2134 (2010).

View Video