Expression, tvättmedel Lösningsgörande, och rening av ett membran transportören, MexB multidrogresistensgenen Protein
Summary
I detta protokoll visar vi uttrycket lösningsgörande, och rening av recombinantly uttryckt membranprotein, MexB som ett lösligt protein rengöringsmedel komplex. MexB är en multidrogresistensgenen membran transportör från de opportunistiska bakteriell patogen Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Multidrogresistensgenen (MDR), möjligheten för en cancercell eller patogen att vara resistent mot ett brett spektrum av strukturellt och funktionellt oberoende cytostatika eller antibiotika, är ett aktuellt allvarligt problem i folkhälsan. Detta multidrogresistensgenen beror till stor del energiberoende pumpar efflux. Pumparna utvisa cytostatika eller antibiotika i externt medium, sänka sina intracellulära koncentrationen under en giftig tröskel. Vi studerar multidrogresistensgenen i Pseudomonas aeruginosa, en opportunistisk bakteriell patogen som orsakar infektioner hos patienter med många typer av skador eller sjukdom, till exempel brännskador eller cystisk fibros, och även i Immuno äventyras-cancer, dialys, och patienter transplantation. De stora MDR effluxpumpar i P. aeruginosa är tre parter komplex består av ett inre membran proton-läkemedel antiporter (RND), ett yttre membran kanal (OMF), och en periplasmic länkare protein (MFP) 1-8. Den RND och OMF proteiner transmembrane proteiner. Transmembrana proteiner utgör mer än 30% av alla proteiner och 65% av nuvarande målproteiner. Den hydrofoba transmembrana domäner gör de proteiner olösliga i vattenlösning buffert. Innan en transmembranös proteinet kan renas är det nödvändigt att hitta buffert villkor som innehåller ett milt diskmedel som gör att proteinet ska solubilized som ett protein rengöringsmedel komplex (PDC) 9-11. I detta exempel använder vi en RND protein, P. aeruginosa MexB transmembrana transportör, för att visa hur man uttrycker en rekombinant form av en transmembranös protein, löses den med diskmedel och sedan rena proteinkomplex rengöringsmedel. Denna allmänna metod kan tillämpas på uttrycket, rening och lösningsgörande många andra recombinantly uttryckt membranproteiner. Proteinet tvättmedel komplex kan senare användas för biokemiska och biofysiska karakterisering inklusive röntgen kristallstruktur beslutsamhet eller studier crosslinking.
Protocol
Discussion
Förutom multidrogresistensgenen, många viktiga cellulära aktiviteter, inklusive jontransport, cell-cell kommunikation, vesikler transporter, underhåll av cellstruktur, och värd-patogen interaktioner, innebär proteiner som är inbäddade i cellmembranet. Transmembrana proteiner utgör över 30% av de kända proteiner och är målen för de flesta läkemedel som används idag. Felaktig fällbara eller aktivitet av transmembrana proteiner leda till viktiga genetiska sjukdomar, inklusive cystisk fibros och diabetes. T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projektet har finansierats med bidrag till CJJ från National Science Foundation och Sällskapet för biomolekylär Sciences.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SDS sample buffer | Biorad | 161-0737 | ||
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | ||
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | ||
| 2XYT media | Fisher | BP2466-2 | ||
| LB media | Fisher | AC61189-5000 | ||
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | ||
| DNaseI | Fisher | BP3226-1 | ||
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | ||
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche | 11 873 580 001 | ||
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | ||
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | ||
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | ||
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | ||
| 15ml tubes | Corning | 430052 | ||
| See-Saw Rocker | Fisher | SSL 4 | ||
| Talon metal affinity resin | Clontech | 635503 | ||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | ||
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | BioRad | 161-1454 | ||
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | BioRad | 161-0732 | ||
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | BioRad | 161-0324 | ||
| Superose 12 30/10 column | GEHealthcareSuperose | 12 10/300 GL | ||
| Amicon centrifugal concentrator | Millipore | UFC801024 | ||
| Syringe filter | Fisher | SLFG R04 NL | ||
| Fernbach flasks | Fisher | 09-552-39 | ||
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | |||
| Akta system | GE Healthcare | |||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman | |||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman | 969329 | ||
| RC-5 centrifuge | ThermoScientific | |||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | ThermoScientific | |||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | ThermoScientific | |||
| T647.5 rotor and tubes with caps | ThermoScientific | 08322 | ||
| French Pressure Cell | ThermoScientific | FA-032 |
References
- Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space. J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).
- Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).
- Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).
- Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).
- Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).
- Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).
- Tikhonova, E. B., Zgurskaya, H. I. AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli Form a Stable Intermembrane Multidrug Efflux. Complex. J. Biol. Chem. 279, 32116-3224 (2004).
- Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).
- Berger, B. W., Gendron, C. M., Robinson, C. R., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. The role of protein and surfactant interactions in membrane-protein crystallization. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 724-730 (2005).
- Jones, M. Surfactants in membrane solubilisation. Int. J. Pharm. 177, 137-159 (1999).
- Maire, M. l. e., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).
