Expression, Waschmittel Solubilisierung und Reinigung von einer Membran Transporter, der MexB Multidrug Resistance Protein
Summary
In diesem Protokoll zeigen wir den Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung von rekombinant exprimierten Membranprotein, MexB, wie ein lösliches Protein Waschmittel komplex. MexB ist ein Multidrug-Resistenz-Membran-Transporter aus der opportunistische bakterielle Erreger Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Multidrug Resistenz (MDR), die Fähigkeit einer Krebszelle oder Erreger eine Resistenz gegen ein breites Spektrum von strukturell und funktionell unabhängigen Anti-Krebs-Medikamente oder Antibiotika, ist eine aktuelle ernstes Problem im öffentlichen Gesundheitswesen. Das Multidrug-Resistenz ist vor allem auf Energie-abhängigen Efflux-Pumpen. Die Pumpen vertreiben Anti-Krebs-Medikamente oder Antibiotika in den externen Datenträger, senken ihre intrazelluläre Konzentration unterhalb einer toxischen Schwelle. Wir untersuchen Multidrug-Resistenz in Pseudomonas aeruginosa, eine opportunistische bakterielle Erreger, die Infektionen verursachen bei Patienten mit vielen Arten von Verletzungen oder Krankheit, z. B. Verbrennungen oder zystische Fibrose, und auch bei immungeschwächten Krebs, Dialyse und Transplantation Patienten. Die wichtigsten MDR Effluxpumpen in P. aeruginosa sind dreigliedrige Komplexe aus einer inneren Membran Proton-Medikament Antiporters (RND), eine äußere Membran-Kanal (OMF) und eine periplasmatische Linker Protein (MFP) 1-8 zusammen. Die RND-und OMF-Proteine sind Transmembranproteine. Transmembranproteine machen mehr als 30% aller Proteine und sind 65% der aktuellen Wirkstoff-Targets. Die hydrophoben Transmembrandomänen machen die Proteine unlöslich in wässrigen Puffern. Bevor ein Transmembranprotein gereinigt werden kann, ist es notwendig, Puffer-Bedingungen mit einem milden Reinigungsmittel, dass das Protein als ein Protein Waschmittel-Komplex (PDC) 9-11 gelöst werden können zu finden. In diesem Beispiel verwenden wir eine RND Protein, das P. aeruginosa MexB Transmembran-Transporter, um zu zeigen, wie man eine rekombinante Form eines Transmembran-Protein exprimieren, lösen sie mit Hilfe von Detergenzien und dann reinigen das Protein Waschmittel-Komplexen. Diese Methode kann die Expression, Reinigung und Solubilisierung von vielen anderen rekombinant exprimierten Membranproteinen angewandt werden. Das Protein Waschmittel-Komplexe können später für biochemische oder biophysikalische Charakterisierung einschließlich X-ray Kristallstrukturbestimmung oder Vernetzung Studien verwendet werden.
Protocol
Discussion
Neben Multidrug-Resistenz, viele lebenswichtige zelluläre Aktivitäten, einschließlich Ionentransport, Zell-Zell-Kommunikation, Vesikeltransport, Wartung der zellulären Struktur und Wirt-Pathogen-Interaktionen beinhalten Proteine, die in die Zellmembran eingebettet sind. Transmembranproteine machen über 30% der bekannten Proteine und sind die Ziele für die Mehrheit der Medikamente heute im Einsatz. Die unsachgemäße Faltung oder Aktivität des Transmembranproteine führen wichtige genetische Kran…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse zu CJJ von der National Science Foundation und der Gesellschaft für Biomolekulare Wissenschaften unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SDS sample buffer | Biorad | 161-0737 | ||
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | ||
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | ||
| 2XYT media | Fisher | BP2466-2 | ||
| LB media | Fisher | AC61189-5000 | ||
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | ||
| DNaseI | Fisher | BP3226-1 | ||
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | ||
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche | 11 873 580 001 | ||
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | ||
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | ||
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | ||
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | ||
| 15ml tubes | Corning | 430052 | ||
| See-Saw Rocker | Fisher | SSL 4 | ||
| Talon metal affinity resin | Clontech | 635503 | ||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | ||
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | BioRad | 161-1454 | ||
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | BioRad | 161-0732 | ||
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | BioRad | 161-0324 | ||
| Superose 12 30/10 column | GEHealthcareSuperose | 12 10/300 GL | ||
| Amicon centrifugal concentrator | Millipore | UFC801024 | ||
| Syringe filter | Fisher | SLFG R04 NL | ||
| Fernbach flasks | Fisher | 09-552-39 | ||
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | |||
| Akta system | GE Healthcare | |||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman | |||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman | 969329 | ||
| RC-5 centrifuge | ThermoScientific | |||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | ThermoScientific | |||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | ThermoScientific | |||
| T647.5 rotor and tubes with caps | ThermoScientific | 08322 | ||
| French Pressure Cell | ThermoScientific | FA-032 |
References
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