Summary

Expression, Waschmittel Solubilisierung und Reinigung von einer Membran Transporter, der MexB Multidrug Resistance Protein

Published: December 03, 2010
doi:

Summary

In diesem Protokoll zeigen wir den Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung von rekombinant exprimierten Membranprotein, MexB, wie ein lösliches Protein Waschmittel komplex. MexB ist ein Multidrug-Resistenz-Membran-Transporter aus der opportunistische bakterielle Erreger Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

Multidrug Resistenz (MDR), die Fähigkeit einer Krebszelle oder Erreger eine Resistenz gegen ein breites Spektrum von strukturell und funktionell unabhängigen Anti-Krebs-Medikamente oder Antibiotika, ist eine aktuelle ernstes Problem im öffentlichen Gesundheitswesen. Das Multidrug-Resistenz ist vor allem auf Energie-abhängigen Efflux-Pumpen. Die Pumpen vertreiben Anti-Krebs-Medikamente oder Antibiotika in den externen Datenträger, senken ihre intrazelluläre Konzentration unterhalb einer toxischen Schwelle. Wir untersuchen Multidrug-Resistenz in Pseudomonas aeruginosa, eine opportunistische bakterielle Erreger, die Infektionen verursachen bei Patienten mit vielen Arten von Verletzungen oder Krankheit, z. B. Verbrennungen oder zystische Fibrose, und auch bei immungeschwächten Krebs, Dialyse und Transplantation Patienten. Die wichtigsten MDR Effluxpumpen in P. aeruginosa sind dreigliedrige Komplexe aus einer inneren Membran Proton-Medikament Antiporters (RND), eine äußere Membran-Kanal (OMF) und eine periplasmatische Linker Protein (MFP) 1-8 zusammen. Die RND-und OMF-Proteine ​​sind Transmembranproteine. Transmembranproteine ​​machen mehr als 30% aller Proteine ​​und sind 65% der aktuellen Wirkstoff-Targets. Die hydrophoben Transmembrandomänen machen die Proteine ​​unlöslich in wässrigen Puffern. Bevor ein Transmembranprotein gereinigt werden kann, ist es notwendig, Puffer-Bedingungen mit einem milden Reinigungsmittel, dass das Protein als ein Protein Waschmittel-Komplex (PDC) 9-11 gelöst werden können zu finden. In diesem Beispiel verwenden wir eine RND Protein, das P. aeruginosa MexB Transmembran-Transporter, um zu zeigen, wie man eine rekombinante Form eines Transmembran-Protein exprimieren, lösen sie mit Hilfe von Detergenzien und dann reinigen das Protein Waschmittel-Komplexen. Diese Methode kann die Expression, Reinigung und Solubilisierung von vielen anderen rekombinant exprimierten Membranproteinen angewandt werden. Das Protein Waschmittel-Komplexe können später für biochemische oder biophysikalische Charakterisierung einschließlich X-ray Kristallstrukturbestimmung oder Vernetzung Studien verwendet werden.

Protocol

1. Tag 1: MexB von Pseudomonas aeruginosa wird durch pFB101 kodiert. Die MexB Gen wurde aus P. verstärkt aeruginosa genomische DNA und in die NdeI und XhoI Restriktionsschnittstellen des pET30b + Vektor. Das Konstrukt enthält einen C-terminalen Hexa-Histidin-tag. Das Plasmid wird verwendet, um E. verwandeln coli-Stamm C43 (DE3) 12, und die Transformanten auf LB Agar mit 30 ug / mL Kanamycin. …

Discussion

Neben Multidrug-Resistenz, viele lebenswichtige zelluläre Aktivitäten, einschließlich Ionentransport, Zell-Zell-Kommunikation, Vesikeltransport, Wartung der zellulären Struktur und Wirt-Pathogen-Interaktionen beinhalten Proteine, die in die Zellmembran eingebettet sind. Transmembranproteine ​​machen über 30% der bekannten Proteine ​​und sind die Ziele für die Mehrheit der Medikamente heute im Einsatz. Die unsachgemäße Faltung oder Aktivität des Transmembranproteine ​​führen wichtige genetische Kran…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse zu CJJ von der National Science Foundation und der Gesellschaft für Biomolekulare Wissenschaften unterstützt.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
SDS sample buffer   Biorad 161-0737  
C43(DE3) E. coli strain   Lucigen 60345-1  
kanamycin sulfate   Sigma-Aldrich K4378  
2XYT media   Fisher BP2466-2  
LB media   Fisher AC61189-5000  
IPTG   Sigma-Aldrich I6758  
DNaseI   Fisher BP3226-1  
Lysozyme   Sigma-Aldrich L7651  
Complete EDTA-free protease inhibitor tablets   Roche 11 873 580 001  
NaP monobasic   Sigma-Aldrich S6566  
NaP dibasic   Sigma-Aldrich S5136  
NaCl   Sigma-Aldrich S6191  
MgCl2   Sigma-Aldrich M1028  
Glycerol   Fisher BP229-1  
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside   Anatrace D310  
15ml tubes   Corning 430052  
See-Saw Rocker   Fisher SSL 4  
Talon metal affinity resin   Clontech 635503  
imidazole   Sigma-Aldrich I5513  
10% polyacrylamide SDS PAGE gels   BioRad 161-1454  
Tris/glycine/SDS PAGE running buffer   BioRad 161-0732  
Kaleidascope prestained molecular weight markers   BioRad 161-0324  
Superose 12 30/10 column   GEHealthcareSuperose 12 10/300 GL  
Amicon centrifugal concentrator   Millipore UFC801024  
Syringe filter   Fisher SLFG R04 NL  
Fernbach flasks   Fisher 09-552-39  
Shaker to hold Fernbach flasks   Fisher Scientific    
Akta system   GE Healthcare    
J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor   Beckman    
1 l centrifuge bottles   Beckman 969329  
RC-5 centrifuge   ThermoScientific    
SS34 fixed-angle rotor and tubes   ThermoScientific    
Sorvall floor model Ultracentrifuge   ThermoScientific    
T647.5 rotor and tubes with caps   ThermoScientific 08322  
French Pressure Cell   ThermoScientific FA-032  

References

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Cite This Article
Bhatt, F. H., Jeffery, C. J. Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein. J. Vis. Exp. (46), e2134, doi:10.3791/2134 (2010).

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