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Biology

Expressão, solubilização, detergente e Purificação de um transportador de membrana, as proteínas MexB resistência a múltiplas drogas

doi: 10.3791/2134 Published: December 3, 2010

Summary

Neste protocolo que demonstram a expressão, solubilização e purificação de uma proteína de membrana recombinantemente expressas, MexB, como um complexo proteína solúvel detergente. MexB é um transportador de membrana multirresistência do oportunista Pseudomonas aeruginosa bacteriana patogênica.

Abstract

Multirresistência (MDR), a capacidade de uma célula cancerosa ou patógeno para ser resistente a uma ampla variedade de estrutural e funcionalmente não relacionados drogas anti-câncer ou antibióticos, é um problema atual graves na saúde pública. Esta resistência a múltiplas drogas é em grande parte devido à energia dependente de bombas de efluxo de drogas. As bombas de expulsar drogas anti-câncer ou antibióticos para o meio externo, reduzindo sua concentração intracelular abaixo de um limiar tóxico. Estamos estudando a resistência a múltiplas drogas em Pseudomonas aeruginosa, um patógeno oportunista que causa infecções bacterianas em pacientes com diversos tipos de lesões ou doença, por exemplo, queimaduras ou fibrose cística, e também em imuno-comprometidos diálise, câncer e pacientes transplantados. As bombas de efluxo MDR grandes em P. aeruginosa são complexos tripartite composta por uma membrana interna antiporter prótons drogas (RND), um canal de membrana externa (OMF), e uma proteína linker periplasmic (MFP) 1-8. As proteínas RND e OMF são proteínas transmembrana. Proteínas transmembrana formam mais de 30% de todas as proteínas e são 65% dos alvos de drogas atual. Os domínios transmembrana hidrofóbica fazer as proteínas insolúveis em tampão aquoso. Antes de uma proteína transmembrana pode ser purificado, é necessário encontrar condições tampão contendo um detergente suave que permitem que a proteína seja solubilizada como um complexo de proteína de detergente (PDC) 11/09. Neste exemplo, usamos uma proteína RND, o P. aeruginosa transportador transmembrana MexB, para demonstrar a forma de expressar uma forma recombinante da proteína transmembrana, solubilizar-lo usando os detergentes, em seguida, purificar o detergente complexos de proteína. Este método geral pode ser aplicado à expressão, purificação e solubilização de muitas outras proteínas da membrana recombinantemente expressas. Os complexos de proteína detergente pode ser usado posteriormente para a caracterização bioquímica ou biofísica, incluindo raios-X a determinação da estrutura de cristal ou estudos de reticulação.

Protocol

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1. Dia 1:

MexB de Pseudomonas aeruginosa é codificado por pFB101. O gene foi amplificado MexB de P. DNA genômico aeruginosa e inserida no NdeI e sítios de restrição XhoI do + pET30b vetor. A construção contém uma tag hexahistidine C-terminal.

  1. O plasmídeo é usado para transformar E. coli cepa C43 (DE3) 12, e os transformantes são semeadas em ágar LB contendo canamicina 30 ug / mL.

2. Dia 2: Culturas Pernoite:

  1. À noite, 4 X 3 culturas LB contendo 30 mL de canamicina ug / mL são inoculados das colônias transformantes fresco. Alternativamente, as culturas podem ser inoculados a partir de uma perm congelados.
    Estas pequenas culturas são cultivadas em um rolo a 37 ° C durante a noite.

3. Dia 3: Growing 6 Culturas Liter:

  1. Na parte da manhã, use as culturas durante a noite para inocular 150 mL contendo 30 LB canamicina ug / mL. Crescer a cultura a 37 ° C em um shaker.
  2. Na parte da tarde, use a cultura pequeno para vacinar 6 x 1L 2XYT mídia contendo 30 ug / mL de canamicina em frascos Fernbach. (Use 25 ml por cultura para uma diluição de 1:40). Crescer as culturas a 37 ° C até atingirem uma DO 600 de 0,4-0,6, cerca de 1,5 horas
  3. Quando as culturas chegar a densidade adequada, induzir a expressão da proteína pela adição de 0,5 mL IPTG 1M. Coloque todos os frascos de volta no shaker e continuar a cultivá-las a 30 ° C durante a noite.

4. Dia 4: A colheita de células e purificação da proteína:

  1. Adicionar inibidores da protease, DNAse, e lisozima às soluções de buffer da seguinte forma: a 50 mL de tampão de ressuspensão de células, adicionar 10 mg DNaseI (0,1 concentração mg / mL final), 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease, e uma pitada de lisozima . A 60 mL de tampão de ressuspensão de membrana, adicionar 1 comprimido inibidor da protease. Para outro de 50 mL de tampão de ressuspensão de membrana, adicionar 1 comprimido inibidor da protease. Manter todas as três soluções no gelo.
  2. Centrifugar as culturas 30 min 5000 rpm em grande escala de centrífuga para a colheita das células.
  3. Ressuspender as células em 100 mL de buffer ressuspensão de células (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease, 0,1 mg / mL DNAse I, pitada de lisozima)
  4. Passe a solução da célula duas vezes através de uma célula de pressão francesa em 12.000 psi (762 pressão manométrica). Recolher o lisado celular em um frasco mantido frio no gelo.
  5. Transferir o lisado celular para SS34 tubos de centrífuga e centrifugar para remover detritos celulares por 30 min a 10.000 rpm a 4 ° C em um rotor SS-34.
  6. Remova cuidadosamente o sobrenadante para tubos de ultracentrífuga Ti647.5. Centrifugação de 50 min a 40.000 rpm a 4C. Desprezar o sobrenadante.
  7. Ressuspender o sedimento, que contém as membranas celulares, em aprox. 25 mL de tampão de ressuspensão de membrana (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease).
  8. Transferir a suspensão de membrana para um tubo de centrífuga limpo e centrifugar a 40.000 rpm em um rotor Ti647.5 por 50 min a 4 ° C.
  9. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet lavado membrana em 25 mL tampão de ressuspensão de membrana (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 1 Complete EDTA livre comprimido inibidor da protease).

5. TM Solublization Protein:

  1. Para as membranas ressuspenso (cerca de 25 mL), adicionar 6 mL DDM 10% (concentração final = DDM detergente 2%) Rock a mistura a 4 ° C por 2 horas.
  2. Centrifugar a mistura a 40.000 rpm por 40 min a 4 ° C no rotor Ti647.5 para separar os complexos detergente proteína solúvel das proteínas insolúveis. Salve o sobrenadante, que contém os complexos detergente MexB proteína.

6. IMAC:

  1. Misture o sobrenadante obtido a partir da rotação de alta velocidade com os grânulos de metal talon afinidade equilibrada em tampão de ressuspensão. Incubar por 1 hora em um rolo a 4 ° C.
  2. Despeje a pasta em um corpo de coluna de fluxo por gravidade e descartar a fluir.
  3. Lavar a coluna com 20 mL (10 volumes de coluna) de tampão de Encadernação e Wash IMAC (50 Nap mM, pH 7, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 0,2% DDM)
  4. Eluir a proteína com tampão de eluição IMAC (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% de glicerol, 250 mM imidazol, 0,2% DDM).
  5. Tome 15 amostras mL das frações de eluição, misture com 15 tampão de amostra 2X SDS mL para análise por eletroforese em gel de poliacrilamida. Spin-30seg em microcentrífuga. Analisar as amostras em um 10% de poliacrilamida SDS gel para estimar a quantidade e pureza de MexB em cada fração.
  6. Piscina das frações contendo os complexos de proteína MexB detergente e concentrá-las em um concentrador de giro a 4 ° C. Tenha cuidado para que a proteína não precipitar nesta step.

7. Coluna de filtração em gel:

  1. Pré-equilibrar um Superose 12 HL 30/10 coluna com 24 mL de tampão execução (50 Nap mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, glicerol 5%, 0,2% de beta-octylglucoside), e esperar por uma base plana.
  2. Lavar a Akta circuito de carga do sistema com tampão de corrida.
  3. Filtrar a solução de proteína usando um filtro de seringa antes de aplicá-la à coluna.
  4. Carga de até 240 mL da solução de proteína para a coluna, com uma concentração de proteína de até 5 mg / mL.
  5. Executar 1,5 volumes de coluna (36 mL) de tampão, coletar frações 0,25 mL. O detergente MexB complexos de proteína deve eluir como um pico em torno de 10-15 mL de volume de eluição.
  6. Take 5 mL de amostras das frações de pico. Mix cada amostra 1:1 com tampão de amostra 2X SDS. Analisar as amostras em gel de poliacrilamida 10% para estimar a quantidade e pureza de MexB em cada fração
  7. Piscina as frações contendo MexB puro.

8. Resultados representativos:

Figura 1 inclui um gel de poliacrilamida com frações obtidos a partir de coluna a coluna IMAC e frações individuais da coluna de filtração em gel. Depois que a coluna de filtração em gel a proteína aparece pura por Coomassie gel de poliacrilamida corado. Figura 2 inclui um rastreio a partir da coluna de filtração em gel mostrando o pico principal do complexo de proteínas detergente eluição da coluna. O rendimento médio de proteína MexB é de aproximadamente 2 mg por 6 litros de cultura 2XYT.

Figura 1
Figura 1. SDS-PAGE em gel de purificação dos PDCs MexB. Lane 1, marcadores de peso molecular. 2, Pooled frações IMAC. 07/03, coluna Gel frações de filtração.

Figura 2
Figura 2. Exemplo de Resultados Gel Filtração para complexos de proteína MexB detergente (PDC).

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Discussion

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Além de multirresistência, muitas atividades vitais celulares, incluindo ion transporte, comunicação célula-célula, transporte de vesículas, a manutenção da estrutura celular e Interações Hospedeiro-Patógeno, envolvem proteínas que são incorporados na membrana da célula. Proteínas transmembrana formam mais de 30% de proteínas conhecidas e são as metas para a maioria dos fármacos em uso hoje. O dobramento imprópria ou atividade das proteínas transmembrana levar a importantes doenças genéticas, incluindo a fibrose cística e diabetes. Apesar da grande importância de proteínas transmembrana, há muito menos sabe sobre as suas estruturas e mecanismos moleculares de proteínas solúveis. A presença de seqüências hidrofóbicas pode tornar difícil de expressar e isolar grandes quantidades dessas proteínas e os torna refratários a muitos métodos bioquímicos e estruturais.

Este protocolo demonstra a expressão solubilização detergente, e purificação de uma proteína de membrana MDR como um complexo proteína solúvel detergente. Estes métodos podem ser usados ​​com algumas modificações para muitas proteínas transmembrana recombinantemente expressas. O resultado complexos detergente proteína purificada são solúveis e podem ser usados ​​para ensaios de cristalização de raios-X a determinação da estrutura cristalográfica e para a caracterização biofísica ou bioquímica, incluindo a reconstituição em lipossomos ou estudos de reticulação.

Durante os procedimentos de purificação, é importante ter cuidado que os complexos de proteína detergente não precipitar durante as etapas de concentração de spin. Diferentes métodos podem também ser usados ​​para ajudar a concentrar o PDC antes ou após a etapa de filtração em gel, como repetindo o passo IMAC com uma coluna muito pequeno e pequeno volume de eluição.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este projeto foi suportado por concessões para CJJ da National Science Foundation e pela Sociedade de Ciências Biomolecular.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SDS sample buffer Bio-Rad 161-0737
C43(DE3) E. coli strain Lucigen 60345-1
kanamycin sulfate Sigma-Aldrich K4378
2XYT media Fisher Scientific BP2466-2
LB media Fisher Scientific AC61189-5000
IPTG Sigma-Aldrich I6758
DNaseI Fisher Scientific BP3226-1
Lysozyme Sigma-Aldrich L7651
Complete EDTA-free protease inhibitor tablets Roche Group 11 873 580 001
NaP monobasic Sigma-Aldrich S6566
NaP dibasic Sigma-Aldrich S5136
NaCl Sigma-Aldrich S6191
MgCl2 Sigma-Aldrich M1028
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310
15ml tubes Corning 430052
See-Saw Rocker Fisher Scientific SSL 4
Talon metal affinity resin Clontech Laboratories 635503
imidazole Sigma-Aldrich I5513
10% polyacrylamide SDS PAGE gels Bio-Rad 161-1454
Tris/glycine/SDS PAGE running buffer Bio-Rad 161-0732
Kaleidascope prestained molecular weight markers Bio-Rad 161-0324
Superose 12 30/10 column GE Healthcare 12 10/300 GL
Amicon centrifugal concentrator EMD Millipore UFC801024
Syringe filter Fisher Scientific SLFG R04 NL
Fernbach flasks Fisher Scientific 09-552-39
Shaker to hold Fernbach flasks Fisher Scientific
Akta system GE Healthcare
J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor Beckman Coulter Inc.
1 l centrifuge bottles Beckman Coulter Inc. 969329
RC-5 centrifuge Thermo Fisher Scientific, Inc.
SS34 fixed-angle rotor and tubes Thermo Fisher Scientific, Inc.
Sorvall floor model Ultracentrifuge Thermo Fisher Scientific, Inc.
T647.5 rotor and tubes with caps Thermo Fisher Scientific, Inc. 08322
French Pressure Cell Thermo Fisher Scientific, Inc. FA-032

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References

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Bhatt, F. H., Jeffery, C. J. Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein. J. Vis. Exp. (46), e2134, doi:10.3791/2134 (2010).More

Bhatt, F. H., Jeffery, C. J. Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein. J. Vis. Exp. (46), e2134, doi:10.3791/2134 (2010).

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