Summary

表現、界面活性剤可溶化、および膜トランスポーター、MexBの多剤耐性タンパク質の精製

Published: December 03, 2010
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Summary

このプロトコルでは、可溶性タンパク質の洗浄剤複合体として、発現、可溶化、および組換え的に発現する膜蛋白質、MexBの精製を示す。 MexBは日和見細菌性病原体は緑膿菌からの多剤耐性膜輸送体である。

Abstract

多剤耐性(MDR)、構造的および機能的に関係のない抗がん剤や抗生物質の広い範囲に耐性であることが癌細胞や病原体の能力は、公衆衛生の現在の深刻な問題です。この多剤耐性がエネルギー依存性の薬剤排出ポンプによるところが大きい。ポンプは、毒性閾値以下にそれらの細胞内濃度を下げる、外部媒体への抗がん剤や抗生物質を排出する。我々は、 緑膿菌 、例えば、怪我や病気の多くのタイプの患者に感染症を引き起こす日和見細菌性病原体、火傷や嚢胞性線維症では、とにも免疫不全のがん、透析、および移植患者における多剤耐性を検討している。 P.における主要なMDRの排出ポンプ緑膿菌は、内膜プロトン-薬物アンチポーター(RND)、外膜のチャネル(OMF)、およびペリプラズムリンカー蛋白質(MFP)1-8から成る三者複合体である。 RNDとOMFタンパク質は、膜貫通蛋白質である。膜貫通型タンパク質は、全てのタンパク質の30%以上を構成し、現在の創薬ターゲットの65%です。疎水性の膜貫通ドメインは、水性緩衝液中のタンパク質が不溶性にします。膜貫通タンパク質を精製することができる前に、それは蛋白質が蛋白質の界面活性剤複合体(PDC)9月11日として可溶化できるように中性洗剤を含む緩衝条件を発見することが必要である。この例では、我々はRNDタンパク質、P.を使用してください、膜貫通タンパク質の組換え形態を表現洗剤を使用して、それを可溶化し、タンパク質の界面活性剤の複合体を精製する方法を示す緑膿菌の MexB貫通型トランスポーター、。この一般的な方法は、発現、精製、および他の多くの組換え的に発現する膜タンパク質の可溶化に適用することができます。タンパク質の洗剤の複合体は、後にX線結晶構造決定や架橋の研究を含む生化学的または生物物理学的特性評価に使用することができます。

Protocol

1。 1日目: 緑膿菌からMexBはpFB101によってエンコードされます。 MexB遺伝子は、P.から増幅された緑膿菌ゲノムDNAおよびpET30b +ベクトルのNdeI及びXhoI制限部位に挿入。構造はC末端ヘキサヒスチジンタグが含まれています。 プラスミドを大腸菌を形質転換するのに使用され大腸菌は、C43(DE3)12株、および形質転換体?…

Discussion

多剤耐性に加えて、イオン輸送、細胞間コミュニケーション、小胞輸送、細胞構造の維持、および宿主 – 病原体相互作用を含む多くの重要な細胞活動は、細胞膜に埋め込まれているタンパク質を含む。膜貫通型タンパク質は、既知のタンパク質の30%以上を構成し、今日使用されている医薬品の大半の目標です。膜貫通型タンパク質の不適切な折りたたみや活動は、嚢胞性線維症や糖尿病な?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

このプロジェクトは、全米科学財団と生体分子科学学会からCJJへの補助金によって支えられている。

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
SDS sample buffer   Biorad 161-0737  
C43(DE3) E. coli strain   Lucigen 60345-1  
kanamycin sulfate   Sigma-Aldrich K4378  
2XYT media   Fisher BP2466-2  
LB media   Fisher AC61189-5000  
IPTG   Sigma-Aldrich I6758  
DNaseI   Fisher BP3226-1  
Lysozyme   Sigma-Aldrich L7651  
Complete EDTA-free protease inhibitor tablets   Roche 11 873 580 001  
NaP monobasic   Sigma-Aldrich S6566  
NaP dibasic   Sigma-Aldrich S5136  
NaCl   Sigma-Aldrich S6191  
MgCl2   Sigma-Aldrich M1028  
Glycerol   Fisher BP229-1  
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside   Anatrace D310  
15ml tubes   Corning 430052  
See-Saw Rocker   Fisher SSL 4  
Talon metal affinity resin   Clontech 635503  
imidazole   Sigma-Aldrich I5513  
10% polyacrylamide SDS PAGE gels   BioRad 161-1454  
Tris/glycine/SDS PAGE running buffer   BioRad 161-0732  
Kaleidascope prestained molecular weight markers   BioRad 161-0324  
Superose 12 30/10 column   GEHealthcareSuperose 12 10/300 GL  
Amicon centrifugal concentrator   Millipore UFC801024  
Syringe filter   Fisher SLFG R04 NL  
Fernbach flasks   Fisher 09-552-39  
Shaker to hold Fernbach flasks   Fisher Scientific    
Akta system   GE Healthcare    
J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor   Beckman    
1 l centrifuge bottles   Beckman 969329  
RC-5 centrifuge   ThermoScientific    
SS34 fixed-angle rotor and tubes   ThermoScientific    
Sorvall floor model Ultracentrifuge   ThermoScientific    
T647.5 rotor and tubes with caps   ThermoScientific 08322  
French Pressure Cell   ThermoScientific FA-032  

References

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Cite This Article
Bhatt, F. H., Jeffery, C. J. Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein. J. Vis. Exp. (46), e2134, doi:10.3791/2134 (2010).

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