التعبير ، Solubilization منظفات ، وتنقية من الناقل الأغشية ، ومقاومة الأدوية المتعددة MexB البروتين
Summary
في هذا البروتوكول نظهر التعبير ، solubilization ، وتنقيتها من بروتين الغشاء أعرب recombinantly ، MexB ، ومجمع للذوبان البروتين المنظفات. MexB هو غشاء المقاومة للأدوية المتعددة من نقل البكتيريا الانتهازية الزائفة الزنجارية الممرض.
Abstract
المقاومة للأدوية المتعددة (MDR) ، وقدرة الخلايا السرطانية أو الممرض أن تكون مقاومة لطائفة واسعة من الأدوية المضادة للسرطان هيكليا ووظيفيا لا علاقة لها أو المضادات الحيوية ، هي مشكلة الخطيرة الراهنة في مجال الصحة العامة. هذه المقاومة لأدوية متعددة يرجع الى حد كبير على الطاقة التي تعتمد على المضخات هروب المخدرات. مضخات طرد الأدوية المضادة للسرطان أو المضادات الحيوية في الوسط الخارجي ، وخفض تركيزها داخل الخلايا دون عتبة السمية. نحن ندرس المقاومة للأدوية المتعددة في الزائفة الزنجارية ، وهو ممرض الانتهازية التي تسبب الالتهابات البكتيرية في المرضى الذين يعانون من أنواع عديدة من الإصابات أو المرض ، على سبيل المثال ، والحروق أو التليف الكيسي ، وكذلك في المناعية للخطر غسيل الكلى والسرطان وزرع الأعضاء والمرضى. وهروب رأس المال في المضخات الرئيسية MDR P. الزنجارية والمجمعات ثلاثية تتكون من بروتون antiporter الداخلية الغشاء المخدرات (التجمع الوطني الديمقراطي) ، وهي قناة الغشاء الخارجي (OMF) ، وبروتين رابط محيط بالجبلة (MFP) 1-8. التجمع الوطني الديمقراطي والبروتينات هي بروتينات عبر الغشاء OMF. البروتينات عبر الغشاء يشكلون أكثر من 30 ٪ من جميع البروتينات ونسبة 65 ٪ من الأهداف المخدرات الحالي. المجالات عبر الغشاء مسعور جعل البروتينات غير قابلة للذوبان في المخزن مائي. قبل أن تتمكن من البروتين النقي عبر الغشاء ، فمن الضروري ايجاد الظروف العازلة التي تحتوي على المنظفات اللطيفة التي تمكن من solubilized البروتين وبروتين معقد المنظفات (PDC) 9-11. في هذا المثال ، نستخدم البروتينات التجمع الوطني الديمقراطي ، وP. نقل عبر الغشاء MexB الزنجارية ، لشرح كيفية التعبير عن المؤتلف شكلا من بروتين عبر الغشاء ، solubilize باستخدام المنظفات ، ومن ثم تنقية البروتين المجمعات المنظفات. ويمكن تطبيق هذه الطريقة العامة في التعبير ، وتنقية ، وغيرها الكثير من solubilization بروتينات غشاء أعرب recombinantly. ويمكن في وقت لاحق مجمعات البروتين المنظفات تستعمل لوصف أو البيوكيميائية البيوفيزيائية بما في ذلك الأشعة السينية تحديد بنية الكريستال أو دراسات يشابك.
Protocol
Discussion
بالإضافة إلى أدوية المتعددة المقاومة ، والعديد من الأنشطة الخلوية الحيوية ، بما في ذلك الاتصالات النقل ايون خلية خلية ، والنقل حويصلة ، وصيانة البنية الخلوية ، والتفاعلات المضيف الممرض ، تنطوي على البروتينات التي هي جزء لا يتجزأ في غشاء الخلية. البروتينات عبر الغشا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد أيد هذا المشروع من خلال منح لCJJ من مؤسسة العلوم الوطنية وجمعية العلوم الجزيئية البيولوجية.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SDS sample buffer | Biorad | 161-0737 | ||
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | ||
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | ||
| 2XYT media | Fisher | BP2466-2 | ||
| LB media | Fisher | AC61189-5000 | ||
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | ||
| DNaseI | Fisher | BP3226-1 | ||
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | ||
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche | 11 873 580 001 | ||
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | ||
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | ||
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | ||
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | ||
| 15ml tubes | Corning | 430052 | ||
| See-Saw Rocker | Fisher | SSL 4 | ||
| Talon metal affinity resin | Clontech | 635503 | ||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | ||
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | BioRad | 161-1454 | ||
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | BioRad | 161-0732 | ||
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | BioRad | 161-0324 | ||
| Superose 12 30/10 column | GEHealthcareSuperose | 12 10/300 GL | ||
| Amicon centrifugal concentrator | Millipore | UFC801024 | ||
| Syringe filter | Fisher | SLFG R04 NL | ||
| Fernbach flasks | Fisher | 09-552-39 | ||
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | |||
| Akta system | GE Healthcare | |||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman | |||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman | 969329 | ||
| RC-5 centrifuge | ThermoScientific | |||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | ThermoScientific | |||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | ThermoScientific | |||
| T647.5 rotor and tubes with caps | ThermoScientific | 08322 | ||
| French Pressure Cell | ThermoScientific | FA-032 |
References
- Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space. J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).
- Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).
- Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).
- Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).
- Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).
- Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).
- Tikhonova, E. B., Zgurskaya, H. I. AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli Form a Stable Intermembrane Multidrug Efflux. Complex. J. Biol. Chem. 279, 32116-3224 (2004).
- Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).
- Berger, B. W., Gendron, C. M., Robinson, C. R., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. The role of protein and surfactant interactions in membrane-protein crystallization. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 724-730 (2005).
- Jones, M. Surfactants in membrane solubilisation. Int. J. Pharm. 177, 137-159 (1999).
- Maire, M. l. e., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).
