Summary

İfade, Deterjan çözünürleştirme ve Membran Transporter, MexB ilaca Direnç Protein Saflaştırılması

Published: December 03, 2010
doi:

Summary

Bu protokolde, çözünebilir bir protein deterjan kompleksi olarak, ifade, çözünmüş ve recombinantly ifade membran proteini, MexB arıtma göstermektedir. MexB fırsatçı bakteriyel patojen Pseudomonas aeruginosa bir çok ilaca direnç membran taşıyıcı.

Abstract

Çok ilaca direnç (MDR), bir kanser hücresi ya da patojen yeteneği, geniş bir yelpazede yapısal ve işlevsel olarak ilgisi olmayan bir anti-kanser ilaçlar ya da antibiyotik dirençli olduğu, halk sağlığı alanında geçerli bir ciddi bir sorundur. Bu ilaca direnci büyük ölçüde bağımlı enerji ilaç dışarı atım pompaları nedeniyle. Pompaları, dış ortama toksik bir eşiğin altında kendi hücre içi konsantrasyonu düşürücü anti-kanser ilaçlar ya da antibiyotik sınırdışı. Biz örneğin, yanıklara veya kistik fibrozis, ve aynı zamanda immün sistemi zayıf olan kanser, diyaliz, ve transplantasyon hastaları, çok ilaca direnç Pseudomonas aeruginosa, birçok yaralanma veya hastalık türleri olan hastalarda enfeksiyonlarına neden olan fırsatçı bir bakteriyel patojen eğitim görmektedir. P. büyük MDR efflux pompaları aeruginosa bir iç membran proton-ilaç antiporter (RND), bir dış membran kanal (OMF) ve bir periplazmik bağlayıcının protein (MFP) 1-8 oluşan üçlü kompleksler. RND ve OMF proteinler transmembran proteinlerdir. Transmembran proteinler tüm proteinlerin% 30'dan fazla makyaj ve% 65 ilaç hedefleri vardır. Hidrofobik transmembran alanları, sulu tampon proteinler çözünmez yapın. Transmembran protein saflaştırılmış önce, hafif bir deterjan içeren bir protein deterjan kompleksi (PDC) 9-11 olarak çözünür protein sağlayacak bir tampon koşulları bulmak için gerekli. Bu örnekte, bir RND protein, P. aeruginosa MexB transmembran taşıyıcı bir transmembran protein rekombinant formu, ifade, bu deterjan kullanarak çözünür ve ardından, protein deterjan kompleksleri arındırmak için nasıl göstermek için. Bu ifade, arıtma, ve diğer birçok recombinantly ifade zarı proteinleri çözünürleştirme genel yöntemi uygulanabilir. Protein deterjan kompleksleri, daha sonra X-ray kristal yapı tayini veya çapraz bağlanma çalışmaları da dahil olmak üzere biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonu için kullanılabilir.

Protocol

1. 1. Gün: Pseudomonas aeruginosa MexB pFB101 kodlanır. P. MexB geni amplifiye edildi aeruginosa genomik DNA ve NdeI ve XhoI kısıtlama siteleri pET30b + vektör eklenir. Bir yapı, bir C-terminal hexahistidine etiketi içerir. Plazmid E. dönüştürmek için kullanılır. coli C43 (de3) 12 suşu ve 30 ug / ml kanamisin içeren LB agar transformants kaplanmıştır. 2. 2. Gün: Gecelik Kü…

Discussion

Direnci, iyon transportu, hücre-hücre iletişimi, vezikül taşıma, hücresel yapı bakım ve konak-patojen etkileşimi de dahil olmak üzere pek çok yaşamsal hücresel faaliyetler, ilaca ek olarak, hücre zarı içinde gömülü olan proteinler içerir. Transmembran proteinler bilinen proteinlerin% 30 üzerinde makyaj ve bugün kullanılan ilaçların büyük çoğunluğu için hedeflerdir. Transmembran proteinler yanlış katlama ya da etkinlik, kistik fibrozis ve diyabet gibi önemli genetik hastalıkların nede…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu proje, Ulusal Bilim Vakfı ve Biyomoleküler Bilimler Derneği CJJ hibe tarafından desteklenen oldu.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
SDS sample buffer   Biorad 161-0737  
C43(DE3) E. coli strain   Lucigen 60345-1  
kanamycin sulfate   Sigma-Aldrich K4378  
2XYT media   Fisher BP2466-2  
LB media   Fisher AC61189-5000  
IPTG   Sigma-Aldrich I6758  
DNaseI   Fisher BP3226-1  
Lysozyme   Sigma-Aldrich L7651  
Complete EDTA-free protease inhibitor tablets   Roche 11 873 580 001  
NaP monobasic   Sigma-Aldrich S6566  
NaP dibasic   Sigma-Aldrich S5136  
NaCl   Sigma-Aldrich S6191  
MgCl2   Sigma-Aldrich M1028  
Glycerol   Fisher BP229-1  
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside   Anatrace D310  
15ml tubes   Corning 430052  
See-Saw Rocker   Fisher SSL 4  
Talon metal affinity resin   Clontech 635503  
imidazole   Sigma-Aldrich I5513  
10% polyacrylamide SDS PAGE gels   BioRad 161-1454  
Tris/glycine/SDS PAGE running buffer   BioRad 161-0732  
Kaleidascope prestained molecular weight markers   BioRad 161-0324  
Superose 12 30/10 column   GEHealthcareSuperose 12 10/300 GL  
Amicon centrifugal concentrator   Millipore UFC801024  
Syringe filter   Fisher SLFG R04 NL  
Fernbach flasks   Fisher 09-552-39  
Shaker to hold Fernbach flasks   Fisher Scientific    
Akta system   GE Healthcare    
J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor   Beckman    
1 l centrifuge bottles   Beckman 969329  
RC-5 centrifuge   ThermoScientific    
SS34 fixed-angle rotor and tubes   ThermoScientific    
Sorvall floor model Ultracentrifuge   ThermoScientific    
T647.5 rotor and tubes with caps   ThermoScientific 08322  
French Pressure Cell   ThermoScientific FA-032  

References

  1. Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space. J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).
  2. Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).
  3. Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).
  4. Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).
  5. Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).
  6. Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).
  7. Tikhonova, E. B., Zgurskaya, H. I. AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli Form a Stable Intermembrane Multidrug Efflux. Complex. J. Biol. Chem. 279, 32116-3224 (2004).
  8. Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).
  9. Berger, B. W., Gendron, C. M., Robinson, C. R., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. The role of protein and surfactant interactions in membrane-protein crystallization. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 724-730 (2005).
  10. Jones, M. Surfactants in membrane solubilisation. Int. J. Pharm. 177, 137-159 (1999).
  11. Maire, M. l. e., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).
  12. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).

Play Video

Cite This Article
Bhatt, F. H., Jeffery, C. J. Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein. J. Vis. Exp. (46), e2134, doi:10.3791/2134 (2010).

View Video