Bu protokolde, çözünebilir bir protein deterjan kompleksi olarak, ifade, çözünmüş ve recombinantly ifade membran proteini, MexB arıtma göstermektedir. MexB fırsatçı bakteriyel patojen Pseudomonas aeruginosa bir çok ilaca direnç membran taşıyıcı.
Çok ilaca direnç (MDR), bir kanser hücresi ya da patojen yeteneği, geniş bir yelpazede yapısal ve işlevsel olarak ilgisi olmayan bir anti-kanser ilaçlar ya da antibiyotik dirençli olduğu, halk sağlığı alanında geçerli bir ciddi bir sorundur. Bu ilaca direnci büyük ölçüde bağımlı enerji ilaç dışarı atım pompaları nedeniyle. Pompaları, dış ortama toksik bir eşiğin altında kendi hücre içi konsantrasyonu düşürücü anti-kanser ilaçlar ya da antibiyotik sınırdışı. Biz örneğin, yanıklara veya kistik fibrozis, ve aynı zamanda immün sistemi zayıf olan kanser, diyaliz, ve transplantasyon hastaları, çok ilaca direnç Pseudomonas aeruginosa, birçok yaralanma veya hastalık türleri olan hastalarda enfeksiyonlarına neden olan fırsatçı bir bakteriyel patojen eğitim görmektedir. P. büyük MDR efflux pompaları aeruginosa bir iç membran proton-ilaç antiporter (RND), bir dış membran kanal (OMF) ve bir periplazmik bağlayıcının protein (MFP) 1-8 oluşan üçlü kompleksler. RND ve OMF proteinler transmembran proteinlerdir. Transmembran proteinler tüm proteinlerin% 30'dan fazla makyaj ve% 65 ilaç hedefleri vardır. Hidrofobik transmembran alanları, sulu tampon proteinler çözünmez yapın. Transmembran protein saflaştırılmış önce, hafif bir deterjan içeren bir protein deterjan kompleksi (PDC) 9-11 olarak çözünür protein sağlayacak bir tampon koşulları bulmak için gerekli. Bu örnekte, bir RND protein, P. aeruginosa MexB transmembran taşıyıcı bir transmembran protein rekombinant formu, ifade, bu deterjan kullanarak çözünür ve ardından, protein deterjan kompleksleri arındırmak için nasıl göstermek için. Bu ifade, arıtma, ve diğer birçok recombinantly ifade zarı proteinleri çözünürleştirme genel yöntemi uygulanabilir. Protein deterjan kompleksleri, daha sonra X-ray kristal yapı tayini veya çapraz bağlanma çalışmaları da dahil olmak üzere biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonu için kullanılabilir.
Direnci, iyon transportu, hücre-hücre iletişimi, vezikül taşıma, hücresel yapı bakım ve konak-patojen etkileşimi de dahil olmak üzere pek çok yaşamsal hücresel faaliyetler, ilaca ek olarak, hücre zarı içinde gömülü olan proteinler içerir. Transmembran proteinler bilinen proteinlerin% 30 üzerinde makyaj ve bugün kullanılan ilaçların büyük çoğunluğu için hedeflerdir. Transmembran proteinler yanlış katlama ya da etkinlik, kistik fibrozis ve diyabet gibi önemli genetik hastalıkların nede…
The authors have nothing to disclose.
Bu proje, Ulusal Bilim Vakfı ve Biyomoleküler Bilimler Derneği CJJ hibe tarafından desteklenen oldu.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
SDS sample buffer | Biorad | 161-0737 | ||
C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | ||
kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | ||
2XYT media | Fisher | BP2466-2 | ||
LB media | Fisher | AC61189-5000 | ||
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | ||
DNaseI | Fisher | BP3226-1 | ||
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | ||
Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche | 11 873 580 001 | ||
NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | ||
NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | ||
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | ||
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | ||
Glycerol | Fisher | BP229-1 | ||
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | ||
15ml tubes | Corning | 430052 | ||
See-Saw Rocker | Fisher | SSL 4 | ||
Talon metal affinity resin | Clontech | 635503 | ||
imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | ||
10% polyacrylamide SDS PAGE gels | BioRad | 161-1454 | ||
Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | BioRad | 161-0732 | ||
Kaleidascope prestained molecular weight markers | BioRad | 161-0324 | ||
Superose 12 30/10 column | GEHealthcareSuperose | 12 10/300 GL | ||
Amicon centrifugal concentrator | Millipore | UFC801024 | ||
Syringe filter | Fisher | SLFG R04 NL | ||
Fernbach flasks | Fisher | 09-552-39 | ||
Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | |||
Akta system | GE Healthcare | |||
J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman | |||
1 l centrifuge bottles | Beckman | 969329 | ||
RC-5 centrifuge | ThermoScientific | |||
SS34 fixed-angle rotor and tubes | ThermoScientific | |||
Sorvall floor model Ultracentrifuge | ThermoScientific | |||
T647.5 rotor and tubes with caps | ThermoScientific | 08322 | ||
French Pressure Cell | ThermoScientific | FA-032 |