Summary
يناقش هذا البروتوكول تشريح حية
Abstract
توضيح آليات النقل محواري أثبتت أنها مهمة جدا في تحديد كيفية العيوب في وسائل النقل لمسافات طويلة تؤثر أمراض عصبية مختلفة. يمكن عيوب أساسية في هذه العملية لها آثار ضارة على أداء الخلايا العصبية والتنمية. قمنا بتطوير بروتوكول التشريح الذي تم تصميمه لفضح
Protocol
1. إعداد الكواشف
- إعداد إعداد العازلة تشريح بإضافة مركبات التالية : 128 مم كلوريد الصوديوم ، 1MM EGTA ، 4 مم MgCl 2 ، 2mm وبوكل ، HEPES 5mm ، و السكروز و 36 ملم في 1000 PH ، إلى 7.2 مل وتصفية تعقيم.
2. التحضير للتشريح
- Siligard المكعب : هو قطع الجل إلى حوالي بوصة واحدة واسعة ، 1 بوصة طويلة وحوالي 1cm عالية. يتم وضع المكعب الجل على شريحة زجاجية أثناء تشريح. ويمكن استخدام مكعبات أكثر من مرة.
- دبابيس : دبابيس تستخدم لتشريح يلزم اضافية قصيرة. في الجزء السفلي من المسامير الحادة minutien يعمل بشكل أفضل في تشريح.
- حاجة واحدة في الربيع microdissection حادة المقص.
- تحتاج اثنين ملقط يميل بشكل جيد.
3. جمع اليرقات
- 3 تجول اليرقات طور مرحلي الثالثة التي تعبر عن البروتين GFP حويصلة الموسومة يتم جمعها على طبق بتري.
- تغسل في ماء منزوع الأيونات اليرقات للتخلص من جميع المواد الغذائية.
4. تعيش تشريح اليرقات
- يتم نقل يرقة إلى تشريح مكعب الجل على شريحة زجاجية. غير منغمسين في اليرقة العازلة تشريح.
- وموهون يرقة في الأمامي والخلفي باستخدام اثنين من الدبابيس بشكل جيد مع الجانب الظهري تصل.
- باستخدام مقص microdissection ، يتم إجراء قطع صغير في المنتصف قرب نهاية الخلفي. من هذا يتم إجراء شق طريق إلى قطع الأمامية. باستخدام اثنين من دبابيس ، دبوس إهاب قطع على الحواف الجانبية.
- إضافة قطرة من تشريح العازلة. إزالة بعناية القناة الهضمية والأمعاء والهيئات الدهون بالملقط. معظم هذه الأنسجة طين عادة من خلال القطع الظهرية.
- استبدال العازلة مع الطازجة العازلة تشريح. يجب أن تكون جافة اليرقة أبدا ، وينبغي أن يكون دائما في تشريح العازلة.
- تتم حضانات تستخدم في الجسم الحي أو علامات MitoTracker LysoTracker في هذا الوقت ، من خلال تمييع في علامة حية في تشريح العازلة. بعد حضانة في علامة فيفو غسل اليرقة تشريح عدة مرات (5 يغسل سريع) باستخدام الطازجة العازلة تشريح.
- بعد استبدال غسل الماضي دفع المسامير في syligard ساترة وعلى الفور. اليرقات جاهز الآن للمراقبة.
5. تعيش اليرقات التصوير تشريح
- ضع ساترة والجل على خشبة المسرح والصورة باستخدام مجهر مجهر مقلوب.
- نستخدم عدسة 100X إلى الحويصلات صورة الموسومة الأعصاب داخل القطعة اليرقات. هو أولا تقييم GFP التعبير في الهيئات خلية من خلايا العقدة البطنية قبل أن يتم تصوير الأعصاب قطعي. إذا لوحظ قوية تلطيخ GFP في الهيئات خلية في بطني العقدة ، ثم يتم تصوير الأعصاب واستخدامها في التقييم.
- باستخدام نظام عرض ثنائي مع المرشحات لCFP / YFP أو YFP RFP / وتقسيم البرنامج عرض في وقت واحد يمكننا صورة اثنين من البروتين المفتاحية في الجسم الحي.
6. ممثل النتائج
الشكل 1 : صورة تظهر حويصلات ممثل محواري محواري كثيرة على مسارات عديدة في عصب قطعي اليرقات لاحظ النقط GFP ، تمثل تراكمات محواري.
الشكل 2 : صورة ممثل يظهر مسار واحد مع محواري محواري حويصلات عديدة داخل عصب قطعي اليرقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في مجال التصوير فيفو النقل حويصلة متشابك داخل الأعصاب يرقات ذبابة الفاكهة قطعي هو أداة قوية لدراسة آليات النقل في محواري. لقد اعتدنا في السابق على هذا البروتوكول لتقييم ديناميات النقل داخل الأعصاب اليرقات يكرر الإعراب عن توسيع polyQ لتوضيح كيفية توسيع يكرر تؤثر على ديناميات النقل حويصلة 3. ويمكن استخدام هذا البروتوكول يتم تحديد سرعة حركة الحويصلة عن طريق تحويل الفيديو إلى تيارات kymograph. استخدام علم الوراثة ، ويمكن نقل GFP الحويصلة يمكن تصور ضمن محور عصبي واحد أو خلال عدة محاور محددة باستخدام GAL4 السائق محرك التعبير عن GFP. بالإضافة إلى ذلك يمكن أيضا أن تكون ديناميكية نقل اليرقات لوحظت في تحمل طفرات لجينات معينة. كذلك يمكن أن اثنين من الحويصلات المفتاحية مع المتغيرات المختلفة GFP (CFP أو RFP) يمكن تصور واحد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويؤيد الأمين العام بأموال من جامعة ولاية نيويورك في بوفالو من مؤسسة جون وOishei ر.
وأيد عضو الكنيست من قبل الطلاب جائزة البحوث التي CURCA في UB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Pair Micro Dissection Scissors | Fine Science Tools | Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter | |
| 2 Pair Forceps | Fisher Scientific | Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps | |
| Box of Dissection Pins | Fine Science Tools | Minutien Pins 0.1mm diameter |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
