Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Live-Präparation
Abstract
Die Aufklärung der Mechanismen der axonalen Transport hat gezeigt, dass sehr wichtig bei der Bestimmung, wie Mängel in Ferntransport verschiedenen neurologischen Erkrankungen beeinflussen. Mängel in diesem wichtigen Prozess kann nachteilige Auswirkungen auf die neuronale Funktion und Entwicklung. Wir haben eine Dissektion Protokoll, das entworfen, um das Expose wird entwickelt
Protocol
1. Vorbereitung der Reagenzien
- Bereiten Sie die Dissektion Puffer Vorbereitung, indem Sie die folgenden Verbindungen: 128 mM NaCl, 1 mM EGTA, 4 mM MgCl 2, 2 mM KCl, 5 mM HEPES und 36 mM Saccharose in 1000 ml, pH auf 7,2 und Filter zu sterilisieren.
2. Vorbereitung für die Präparation
- Siligard cube: Das Gel wird auf etwa einen Zentimeter breit, 1 cm lang und ca. 1cm hoch geschnitten. Das Gel Würfel ist auf einem Glasträger beim Präparieren platziert. Cubes können mehr als einmal verwendet werden.
- Pins: Pins für die Präparation verwendet werden müssen extra kurz. Die scharfen unteren Teil des minutien Pins funktioniert am besten in Dissektion.
- Brauchen Sie eine scharfe Schere Mikrodissektion Frühjahr.
- Brauchen Sie zwei feinen Spitzen einer Pinzette.
3. Sammlung von Larven
- Wandering 3 rd Larvenstadium, die, die ein GFP markiert Vesikelprotein sind auf einer Petrischale gesammelt.
- Die Larven werden in deionisiertem Wasser gewaschen, um loszuwerden, alle Lebensmittel.
4. Live-Präparation von Larven
- Eine Larve ist es, die Dissektion Gel Würfel auf einem Glasträger übertragen. Larva ist in Dissektion Puffer eingetaucht.
- Larva ist an der vorderen und hinteren mit zwei feinen Nadeln mit dem Rücken nach oben schmachtete.
- Mit Mikrodissektion Schere, wird ein kleiner Schnitt an der Mittellinie in der Nähe des hinteren Endes gemacht. Von diesem Schnitt ein Schnitt durch den vorderen gemacht. Mit zwei Stiften, Bolzen der Schnitt Nagelhaut an den seitlichen Rändern.
- Geben Sie einen Tropfen zu sezieren Puffer. Entfernen Sie vorsichtig den Darm, Darm und Fettkörper mit einer Pinzette. Die meisten dieser Gewebe normalerweise sickern in den Rücken schneiden.
- Ersetzen Sie den Puffer mit frischen Sezieren Puffer. Die Larve sollte nie trocken sein und sollte ständig in Sezieren Puffer sein.
- Inkubationen mit in vivo Markern MitoTracker oder LysoTracker sind in dieser Zeit getan, durch Verdünnen der in vivo-Marker in Dissektion Puffer. Nach der Inkubation der in vivo-Marker waschen seziert Larve mehrere Male (5 schnelle wäscht) mit frischen Sezieren Puffer.
- Nach dem Austausch der letzten Waschung drücken Sie die Stifte in die syligard und sofort Deckglas. Die Larven ist nun bereit für die Beobachtung.
5. Live-Darstellung von seziert Larven
- Legen Sie das Deckglas und Gel auf dem Mikroskoptisch und Bild mit einem inversen Mikroskop.
- Wir verwenden eine 100x-Objektiv zum Bild getaggt Vesikel innerhalb Larven segmentalen Nerven. GFP-Expression in den Zellkörper der Bauchganglion wird zuerst ausgewertet, bevor segmentalen Nerven abgebildet werden. Wenn robust GFP Färbung in die Zellkörper in der ventralen Ganglion beobachtet wird, sind die Nerven dann abgebildet und zur Auswertung herangezogen.
- Mit einem Dual-View-Systems mit Filtern für CFP / YFP oder RFP / YFP und geteilte Ansicht Software, die wir gleichzeitig Bild können zwei markierte Protein in vivo.
6. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1:. Ein repräsentatives Bild zeigt viele axonalen Bläschen auf viele axonalen Tracks innerhalb eines larvalen segmentalen Nerven Beachten Sie die Tropfen von GFP, was axonalen Ansammlungen.
Abbildung 2: Ein repräsentatives Bild zeigt ein einzelnes Axon Strecke mit vielen axonaler Vesikel innerhalb eines larvalen segmentalen Nerven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In-vivo-Bildgebung der synaptischen Vesikel Transport innerhalb Drosophila Larve segmentalen Nerven ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Erforschung der Mechanismen in axonalen Transport. Wir haben bereits dieses Protokoll verwendet, um den Transport Dynamik innerhalb larvalen Nerven Ausdruck erweitert polyQ wiederholt, um aufzuklären, wie Ausbau der wiederholt die Dynamik der Vesikeltransport beeinflussen 3 zu bewerten. Über dieses Protokoll die Geschwindigkeit der Vesikel Bewegung kann durch die Umwandlung der Video-Streams zu einem Kymographion bestimmt werden. Mit Genetik, können GFP Vesikeltransport werden in einem einzigen Axon oder in mehrere Axone visualisiert durch eine spezifische GAL4-Treiber, die Expression von GFP-Laufwerk. Zusätzlich wird die Dynamik des Verkehrs können auch in Larven, die Mutationen für bestimmte Gene beobachtet werden. Weitere zwei Vesikel mit verschiedenen GFP-Varianten (GFP oder RFP) markiert werden können gleichzeitig visualisiert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
SG wird durch Mittel aus der State University of New York at Buffalo und von John R. Oishei Foundation unterstützt.
MK wurde von einem Student Research Award CURCA bei UB unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Pair Micro Dissection Scissors | Fine Science Tools | Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter | |
| 2 Pair Forceps | Fisher Scientific | Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps | |
| Box of Dissection Pins | Fine Science Tools | Minutien Pins 0.1mm diameter |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
