Summary
Questo protocollo descrive la dissezione dal vivo di
Abstract
Chiarire i meccanismi di trasporto assonale ha dimostrato di essere molto importante nel determinare come i difetti nel trasporto a lunga distanza influenzare diverse malattie neurologiche. Difetti in questo processo essenziale può avere effetti negativi sul funzionamento dei neuroni e lo sviluppo. Abbiamo sviluppato un protocollo di dissezione che è stato progettato per esporre la
Protocol
1. Preparazione dei reagenti
- Preparare la preparazione del buffer dissezione aggiungendo i seguenti composti: 128 mM NaCl, 1mM EGTA, 4 mM MgCl 2, 2mM KCl, HEPES 5mm, e 36 mM saccarosio nel 1000 mL, PH a 7,2 e filtro sterilizzare.
2. Preparazione per la dissezione
- Cubo Siligard: Il gel viene tagliato a circa un centimetro di larghezza, 1 pollice di lunghezza e circa 1 cm di altezza. Il cubo di gel viene posto su un vetrino durante la dissezione. Cubi possono essere utilizzati più di una volta.
- Pin: pin utilizzati per la dissezione bisogno di essere più breve. La parte inferiore tagliente di pin minutien funziona meglio in dissezione.
- Bisogno di un forte forbici primavera microdissezione.
- Hai bisogno di due pinze a punta sottile.
3. Raccolta delle larve
- Vagando 3 ° larve instar che stanno esprimendo un tag vescicola proteina GFP sono raccolti su una piastra di Petri.
- Le larve vengono lavati in acqua deionizzata per sbarazzarsi di tutto il cibo.
4. Dissezione dal vivo di larve
- Una larva è trasferito al cubo dissezione gel su un vetrino. Larva è immerso nel buffer dissezione.
- Larva si struggeva al anteriore e posteriore con due perni bene con la parte dorsale fino.
- Utilizzando le forbici microdissezione, un piccolo taglio viene effettuato presso la linea mediana verso la fine posteriore. Da questa incisione è fatta un taglio fino al anteriore. Utilizzando due pin, pin, la cuticola taglio sui bordi laterali.
- Aggiungere una goccia di dissezione buffer. Rimuovere con attenzione l'intestino, intestino e organi di grasso con una pinza. La maggior parte di questi tessuti normalmente fuoriuscita durante il taglio dorsale.
- Sostituire il buffer con fresca tampone dissezione. La larva non deve mai essere asciutto e deve essere costantemente in dissezione buffer.
- Incubazioni utilizzando in vivo MitoTracker marcatori o LysoTracker sono fatte in questo momento, diluendo il marcatore in vivo nel buffer di dissezione. Dopo l'incubazione del marcatore in vivo lavare la larva sezionato diverse volte (5 lavaggi rapido) con ingredienti freschi buffer di dissezione.
- Dopo aver sostituito l'ultimo lavaggio spingere i perni nel syligard e subito coprioggetto. Le larve è ora pronto per l'osservazione.
5. Immagini dal vivo di larve sezionato
- Posizionare il coprioggetto e gel sul palco microscopio e l'immagine utilizzando un microscopio invertito.
- Noi usiamo una lente a 100x vescicole immagine tag all'interno larvale nervi segmentale. Espressione GFP nei corpi delle cellule del ganglio ventrale viene prima valutato prima di nervi segmentali sono ripreso. Se la colorazione GFP robusta è osservata nel corpo cellulare nel ganglio ventrale, i nervi sono poi fotografato e usato per la valutazione.
- Utilizzando un sistema dual vista con filtri per CFP / YFP o RFP / YFP e visualizzare i software divisi possiamo simultaneamente immagine due proteine tag in vivo.
6. Rappresentante Risultati
Figura 1:. Un'immagine rappresentante che mostra molte vescicole assonale su molte piste assonale in un nervo larvale segmentale Notare le macchie di GFP, che rappresentano accumuli assonale.
Figura 2: Una immagine rappresentativa che mostra una singola traccia assonale con molte vescicole assonale all'interno di un nervo larvale segmentale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In imaging in vivo di trasporto all'interno delle vescicole sinaptiche Drosophila nervi larvale segmentale è un potente strumento per studiare i meccanismi di trasporto assonale. Abbiamo già utilizzato questo protocollo per valutare le dinamiche di trasporto all'interno di nervi larvale esprimere ampliato ripete polyQ per chiarire come l'espansione delle ripetizioni condizionare le dinamiche del trasporto delle vescicole 3. Utilizzando questo protocollo la velocità di movimento delle vescicole possono essere determinati convertendo i flussi video a un chimografo. Utilizzando la genetica, il trasporto delle vescicole GFP può essere visualizzata all'interno di un singolo assone o all'interno di diversi assoni usando uno specifico GAL4 a guidare l'espressione di GFP. Inoltre le dinamiche di trasporto può essere osservata anche nelle larve portatori di mutazioni di specifici geni. Altri due vescicole taggati con diverse varianti GFP (PCP o RFP) possono essere visualizzati simultaneamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
SG è sostenuto da fondi del State University di New York a Buffalo e da John R. Oishei Foundation.
MK è stato sostenuto da un premio di ricerca da parte degli studenti CURCA UB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Pair Micro Dissection Scissors | Fine Science Tools | Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter | |
| 2 Pair Forceps | Fisher Scientific | Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps | |
| Box of Dissection Pins | Fine Science Tools | Minutien Pins 0.1mm diameter |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
