Summary
이 프로토콜은의 라이브 절개를 설명
Abstract
axonal 수송의 메커니즘을 Elucidating하면 장거리 수송의 결함은 다른 신경 질환에 미치는 영향에 대해 결정에서 매우 중요하다고 표시했습니다. 이 필수 과정에서 결함의 연결 기능 및 개발에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는을 폭로하기 위해 설계되었습니다 해부 프로토콜을 개발했습니다
Protocol
1. 시약의 준비
- 7.2 및 필터 소독 128 MM NaCl, 1mM EGTA, 4 MM MgCl 2, KCl 2mM, 5mM HEPES, 1000 ML, PH 36 MM의 자당 다음 화합물을 추가하여 해부 버퍼 준비를 준비합니다.
2. 해부를위한 준비
- Siligard 큐브 : 겔은 약 인치 와이드, 1 인치 길이 높이 약 1cm로 잘라입니다. 겔 큐브는 절개 중에 유리 슬라이드에 배치됩니다. 큐브는 두 번 이상 사용할 수 있습니다.
- 핀 : 해부에 사용되는 핀 짧게 추가해야합니다. minutien 핀의 날카로운 아래 부분 절개에서 최상의 상태로 작동합니다.
- 한 날카로운 microdissection 스프링 가위가 필요합니다.
- 이 좋은 밀고 포셉 필요합니다.
3. 애벌레 수집
- GFP 태그 소포 단백질을 표현 아르 제 3 instar의 애벌레를 방황하는 것은 배양 접시에 저장됩니다.
- 애벌레는 모든 음식을 없애 탈이온수에 씻어 수 있습니다.
4. 애벌레의 라이브 해부
- 유충은 유리 슬라이드에 절개의 겔 큐브로 전송됩니다. 유충은 해부 버퍼에 포장되어 있습니다.
- 유충은 앞쪽에와 후부가 등의 측면을 가진 두 개의 좋은 핀을 이용하여 pined 있습니다.
- microdissection 가위를 사용하여, 작은 상처는 사후 끝에 근처에있는 정중선에서 이루어집니다. 이 절개의 상처가 앞쪽이을 통해 이루어집니다. 이 핀을 사용하여 측면 가장자리에 자른 표피를 핀.
- 버퍼를 해부 한 방울을 추가합니다. 조심스럽게 포셉과 창자, 내장 지방의 시체를 제거합니다. 이러한 조직의 대부분은 일반적으로 지느러미 절단하는 동안 밖으로 스며 나오게하다.
- 신선한 해부 버퍼로 버퍼를 교체합니다. 유충은 건조한 않을 것입니다 그리고 지속적으로 버퍼를 해부에 있어야합니다.
- 생체내 마커의 MitoTracker 또는 LysoTracker에서 사용 Incubations는 해부 버퍼의 생체내 마커의를 diluting하여,이 시간에 이루어집니다. 생체내 표지에의 부화 후 해부 유충에게 신선한 해부 버퍼를 사용하여 여러 번 (5 빠른 세척) 씻으십시오.
- 교체 후 마지막 세차 syligard 즉시 coverslip에 핀을 밀어. 애벌레는 이제 관찰을위한 준비가되었습니다.
5. 해부 애벌레의 라이브 영상
- 현미경 스테이지와 거꾸로 현미경을 사용하여 이미지에 coverslip와 젤 놓습니다.
- 우리는 애벌레 segmental 신경 이내에 이미지 태그를 vesicles로 100x 렌즈를 사용합니다. segmental 신경이 몇 군데되기 전에 복부 신경절의 세포 기관에서 GFP 발현 먼저 평가됩니다. 강력한 GFP의 얼룩이 복부 신경절에 세포 기관에서 관찰하면, 신경은 다음 몇 군데와 평가를 위해 사용됩니다.
- CFP / YFP 또는 RFP / YFP에 대한 필터와 분할보기 소프트웨어 생체내에서 우리가 할 수있는 동시에 이미지를 두 개의 태그 단백질과 듀얼 뷰 시스템을 사용합니다.
6. 대표 결과
그림 1 :. 애벌레 segmental 신경 내에 많은 axonal 트랙에 많은 axonal vesicles을 보여주는 대표 이미지 axonal 쌓일 대표, GFP의 모양을 확인합니다.
그림 2 : 애벌레 segmental 신경 내에 많은 axonal vesicles로 단일 axonal 트랙을 보여주는 대표 이미지.
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Discussion
Drosophila 애벌레 segmental 신경 사이 시냅스 소포 수송의 생체내 이미징에서 axonal 교통의 메커니즘을 연구를위한 강력한 도구입니다. 우리는 이전 반복의 확장은 소포 수송 3 역학에 미치는 영향 명료하게하다 확대 polyQ 반복을 표현 애벌레 신경 내에 전송 역학을 평가하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 이 프로토콜을 사용하는 것은 소포 운동의 속도는 kymograph에 비디오 스트림을 변환하여 결정하실 수 있습니다. 유전학 사용하여 GFP의 소포 운송은 GFP의 표현을 드라이브에 특정 GAL4 드라이버를 사용하여 단일 축삭 내에서 또는 여러 axons 이내 시각하실 수 있습니다. 또한 교통의 역학은 또한 특정 유전자에 대한 변이를 들고 유충에서 볼 수 있습니다. 또한 다른 GFP 변종 (CFP 또는 RFP)로 태그가이 vesicles 동시에 시각하실 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
SG는 버팔로의 뉴욕 주립 대학에서와 존 R. Oishei 재단 기금에 의해 지원됩니다.
MK는 UB의 CURCA하여 학생 연구 수상에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Pair Micro Dissection Scissors | Fine Science Tools | Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter | |
| 2 Pair Forceps | Fisher Scientific | Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps | |
| Box of Dissection Pins | Fine Science Tools | Minutien Pins 0.1mm diameter |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
