Summary
בסרטון זה אנו משתמשים adenovirus נושאת את הגן Cre recombinase להדביק fibroblasts העכבר העיקרי העוברית נושאת אלל floxed Rac1.
Abstract
היכולת גנטית להסיר רכיבים ספציפיים של מפלי איתות שונים בתא כבר כלי אינטגרלי ניתוח אות המודרנית התמרה. שיטה אחת מסוימת כדי להשיג זאת היא באמצעות מחיקה מותנה שימוש במערכת Cre-loxP. שיטה זו כרוכה איגוף את הגן של עניין עם אתרי loxP, שהם רצפי הכרה ספציפית לחלבון recombinase Cre. חשיפה של ה-DNA המכונים (מוקף אתר loxP) floxed זה תוצאות האנזים במקרה Cre בתיווך רקומבינציה באתרי loxP, ואת הבאים כריתה של הגן להתערב 3. קיימים מספר שיטות שונות כדי לנהל Cre recombinase לאתר של עניין. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את השימוש adenovirus המכיל את הגן Cre recombinase להדביק fibroblasts העכבר העיקרי עובריים (MEFs) המתקבלים עוברים המכילים אלל floxed Rac1 1. הרציונל שלנו לבחירת Rac1 MEFs לניסויים שלנו היא כי שינויים מורפולוגיים ברור ניתן לראות על מחיקה של Rac1, עקב שינויים cytoskeleton אקטין 2,5. 72 שעות לאחר התמרה ויראלי ביטוי Cre, התאים היו מוכתמים באמצעות צבע אקטין phalloidin הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. היה נראה כי MEFs שנחשפו לנגיף adeno-Cre הופיע התכווץ ומוארך במורפולוגיה לעומת תאים נגוע, עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים 2,5. השיטה adenovirus המסירה recombinase Cre יתרון כמו וירוס adeno-Cre זמין בקלות, באמצעות מחיקת הגן Cre של כמעט 100% של התאים ניתן להשיג עם זיהום adenoviral אופטימיזציה.
Protocol
הפשרת התאים
- השג fibroblasts עכבר קפוא עובריים (MEFs) (שנוצר בעבר מתרבויות העובר הפרט העיקרי) של חנקן נוזלי.
- תאים הפשירי ידי טבילה בקבוקון מים ב 37 ° C עד מתערבל עם תוכן הם מופשר לחלוטין.
- הוסף 9mL של DMEM כי כבר השלימו עם סרום 10% שור עוברית 1% פניצילין, סטרפטומיצין על צלחת תא 10 ס"מ תרבות.
- מוסיפים את ההשעיה תא מופשר ירידה מבחינת הצלחת, סלע את הצלחת בעדינות לפיזור תאים צלחת מקום 37 ° C CO, 5% 2 החממה לילה. שים לב שאם תאים רגישים DMSO (מתהליך קריותרפיה), אמצעי התקשורת הראשוני יכול להיות מוחלף עם התקשורת לאחר טרי התאים דבק הצלחת (כארבע שעות ציפוי לתגובה). כמו כן שים לב כי מפגש של התאים לאחר ההפשרה תלויה במספר תאים קפואים, קצב התאוששות של תאים לאחר הקפאה, ושיעור הצמיחה של התאים.
Passaging תאים
- כאשר התאים גדלו למעשה 100% confluency (כלומר: למחרת), לשאוב את התקשורת לשטוף תאים עם 5 מ"ל של PBS סטרילית.
- הסר PBS ולהוסיף 1mL של טריפסין המכיל 10mm EDTA צלחת מקום בחממה במשך כ 5 דקות, כדי לאפשר לתאים לנתק מהצלחת.
- כאשר תאים יש מנותקת, להוסיף 9mL התקשורת לתאי trypsinized, פיפטה 2-3 פעמים כדי לפזר גושים, מוסיפים 1mL של השעיה זו ירידה מבחינת לצלחת חדש המכיל 9mL של התקשורת, במקום הזה לתוך 37 ° C חממה לילה . הנוכחות של FBS בתקשורת יהיה להשבית טריפסין לחילופין, תאים ניתן לכבס הראשון לדלל את טריפסין.
ספירת תאים ו ציפוי על גבי תלושי לכסות
- הסרת תאים חממה, לרחוץ trypsinize כמו קודם, אלא שהפעם להוסיף 5-6mL התקשורת חזרה את התאים trypsinized במקום 9mL.
- תאים פיפטה ביסודיות כדי להבטיח ניתוק מוחלט לתוך ההשעיה תא בודד, ולהסיר 15μL לשלב עם 15μL של trypan כחול בצינור microfuge נפרד.
- מערבבים את ההשעיה תא / trypan כחול על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים, כדי להוסיף 15μL hemocytometer.
- מתחת למיקרוסקופ, תאים מתים יופיעו בצבע כחול. ספירת התאים ברור / צבע (חי) באחד רשתות 4X4 על hemocytometer. חזור על פעולה זו מספר על שלוש רשתות אחרות 4X4 (מצוין, B, C ו-D) ולהשתמש המשוואה הבאה כדי לחשב את מספר התאים לכל μL של השעיה:
- באמצעות אופטימיזציה של פרוטוקול, יש לנו קבעו כי ציפוי 30,000 תוצאות תאים צפיפות התאים המתאימים להדמיה בסיומו של הניסוי.
- כדי לחשב את נפח תא ההשעיה הדרושים 30,000 תאים, השתמש המשוואה הבאה:
- עכשיו במקום זכוכית סטרילית לכסות להחליק לתוך היטב כל מנה שישה היטב ולהוסיף 2ml של התקשורת זה היטב, ולאחר מכן להוסיף טיפה חכם מן ההשעיה הסלולרי שלך נפח הנדרש 30,000 תאים לתוך כל טוב. שים לב לכסות תלושי כוס משמשים בניסוי זה כפי שאנו יהיה לדמיין את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשלב מאוחר יותר, לא כל היישומים דורשים בהכרח מיקרוסקופ, ובכך מכסה מחליק לא ייתכן שתידרש.
וירוס התמרה
- אחרי כמה שעות (או זמן מספיק על מנת להבטיח כי התאים לדבוק תלושי כיסוי) למשך הלילה, להסיר ולשטוף התקשורת תאים עם 1mL של סרום ללא DMEM.
- הוסף 1mL של סרום ללא מדיה גם עבור כל תוספת של הנגיף. לצורך ניסוי זה, adeno-Cre וירוס הושג מסחרית מן Biolabs וקטור.
- אופטימיזציה של פרוטוקול קודם הראה כי ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 500 מספק התמרה גן היעילה ביותר תוך MEFs ראשוני עם מעט או ללא השפעה על כדאיות התא. משרד הפנים יכול להיות מחושב באופן הבא:
- מוסיפים את נפח מחושב של הנגיף ישירות היטב כל זה להיות נגוע, רוק בעדינות את הצלחת לפזר את התאים וירוס מקום לתוך 37 ° C חממה לילה.
- למחרת בבוקר, להסיר את הווירוס המכילים מדיה מן התאים ולשטוף תאים 1mL סטרילי PBS ולאחר מכן להוסיף 2ml התקשורת קבוע היטב כל אחד.
- במקרה של Rac1 תאים שהודגם בניסוי הזה, התרחשו שינויים מורפולוגיים בתאים על כ 72 שעות שלאחר התמרה.
נציג תוצאות
תאים היו לדמייןד על ידי צביעה עם צבע אקטין phalloidin (למטרות הדמיה בלבד) צילמו באמצעות TCS-Leica SP5 multiphoton מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר במרכז ניתוח מתקדם באוניברסיטת Guelph. איור 1 מציג את המורפולוגיה התכווצה מוארכת של Rac1 flox / flox תאים שנחשפו לנגיף adeno-Cre לעומת התאים אותו לא נחשף לנגיף.
באיור 1. השוואה בין תאים Rac1 flox / flox נגוע adeno-Cre וירוס (משמאל) לעומת תאים נגוע מאותו מקור (מימין).
Discussion
הסרטון מלווה מדגים כיצד וירוס רקומביננטי יכול לשמש גן הבלו ספציפי במבחנה באמצעות Cre recombinase. הפיתוח של פרוטוקול זה אך לא לחשוף כמה נקודות מסוים ראוי להתייחסות.
- נהלי בטיחות פרופר תמיד צריך להיות מועסק בעבודה עם adenoviruses. חלוק מעבדה וכפפות יש ללבוש כל הזמן תוך כדי עבודה עם הנגיף. מדיה כלי פלסטיק צריכים להיות מטופלים עם אקונומיקה 10% לפחות במשך 30 דקות, כלי פלסטיק צריכים להיות autoclaved לאחר מכן.
- הימנע חזר להקפיא הפשרת המניה וירוס כמו זה יכול להשפיע על titer וירוס ובכך להפחית את היעילות התמרה. כמויות קטנות של המניה אמור בתחילה להיות וירוס aliquoted לתוך צינורות נפרדים.
- MOIs החל 5-50 נבדקו במהלך התפתחות שיטת ושיעורי התמרה יעיל נצפו ברוב המקרים, ללא השפעות שליליות על כדאיות התא.
- Adeno-GFP נעשה שימוש גם במהלך פיתוח שיטה מהירה מסך יעילות התמרה. שליטה זו (או וקטור ריק) צריכה להתנהל במהלך הניסוי על מנת להבטיח כי זיהום ויראלי לבד אינו תוצאה של השינויים התאיים. באופן דומה, אם מוציא את הגן floxed עניין בתאים שלך אינו תוצאה של שינויים הסלולר (כלומר שינויים במורפולוגיה או הכדאיות), ואז מדביק את סוג התא אותו עם adeno-GFP הוא פקד חשוב להשתמש על מנת להוכיח כי התמרה וירוס התרחשות.
מעבר לבחינת איתות מפלי בתרבות, הגישה adeno-Cre גם הועסק in vivo כדי להסיר תנאי גנים מחיות הניסוי 3,4, ו לתייג אוכלוסיות ספציפיות של תאים בתוך האורגניזם 6. המערכת adenovirus יכול גם להיות מותאם להציג גנים אחרים מאשר Cre recombinase לתאי המארח. שני היתרונות העיקריים של שימוש זה וקטור משלוח הם התמרה גבוהה ואספקה יעילות גן, וחוסר אינטגרציה עם ה-DNA המארח. אולם, את הדור של adenoviruses רקומביננטי רומן יכול להיות עבודה אינטנסיבית. הפרוטוקול המתואר כאן ולכן רותמת את העוצמה של המערכת adenoviral ידי ניצול שפותחו בעבר adeno-Cre וירוסים, צימוד זה עם אלל floxed שלנו של עניין, Rac1. דרך לדפוק את הניסוי הזה מותנה, יש לנו אישר כי התמרה באמצעות וירוס adeno-Cre של MEFs נושאת אלל Rac1 floxed אכן לגרום כריתה של Rac1 המוביל את השינויים האופייניים מורפולוגיה תאית של תאים Rac1 מחסר 2,5.
Disclosures
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי המועצה הקנדית על בריאות בעלי חיים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לד"ר Rizaldy סקוט בהר סיני החולים בטורונטו, אונטריו עבור מתנתו של הראשוני Rac1 flox / flox fibroblasts העכבר עובריים. עבודה זו נתמכה על ידי הפעלה מענקים NJ מן המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR, MOP 2009-93526) ואת מדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC, RG 327372-06). SH ו MW נתמכים על ידי CGSMA ו cgs-M פרסים CIHR ו NSERC, בהתאמה.
סטיב צוואות האולי ומלאני תרמו באופן שווה על הנייר הזה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad-CMV-Cre virus | Vector Biolabs | 1045 | |
| DME High glucose media 500mL | Fisher Scientific | SH3002201 | |
| FBS Canadian origin 500mL | VWR international | CAA15-701 | |
| PEN-STREP 1X solution 100mL | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Texas Red-X phalloidin | Invitrogen | T7471 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4549 |
References
- Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly. J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).
- Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. owney, Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions. J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).
- Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion. Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).
- Rijnkels, M., Rosen, J. M. Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells. J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).
- Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor. Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).
- Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus. Genesis. 44, 51-56 (2006).
